鄧冠軍 , 湯明禮 , 張 旋, 黃勝威, 吳麗芳

(1. 安徽大學 生命科學學院, 合肥 230039； 2. 中國科學院 合肥物質科學研究院離子束生物工程學重點實驗室 國家林業(yè)局能源林研究中心, 合肥 230031)

黃連木(PistaciachinensisBunge)屬于漆樹科黃連木屬落葉喬木，在中國廣泛分布。其種子平均含油率約35.05%，出油率為20%～30%[1]，具有開發(fā)優(yōu)質食用油的潛質[2]。黃連木樹皮、樹葉均可入藥[3]，果實、果柄和葉富含揮發(fā)油，對植物病原真菌具有一定的抑制作用[4]。此外，黃連木樹各部分都有特殊氣味，熬制的水溶液是較好的農(nóng)藥，可殺各種水稻害蟲和蚜蟲。研究顯示，黃連木的不同部位都富含多酚類物質[5]。因此針對黃連木葉進行多酚提取分離研究，并挖掘其生物活性，為進一步提高對黃連木的綜合利用提供理論和技術支撐。

氧化應激被認為是很多疾病的病理發(fā)生的一個重要因素，比如腫瘤、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥的疾病等,當體內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS對蛋白質、脂肪、DNA和其它生物分子都有很大的破壞，導致細胞喪失整體性和一些功能。植物提取物具有廣泛地生物活性，其中抗氧化活性與延遲衰老和抗腫瘤等密切相關。本文采用經(jīng)濟、簡便、快速可靠的方法(DPPH和FRAP法)對純化后產(chǎn)物的抗氧化活性進行快速評價。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)與人類基因有60%～80%同源[6]，很多生物學基礎和哺乳類動物也高度一致，而且生活史短。因而，秀麗隱桿線蟲經(jīng)常被用作抗氧化、衰老和環(huán)境毒理等研究及藥物靶位點的篩選[7-9]。本文以線蟲為活體模型，對黃連木葉純化多酚的體內(nèi)抗氧活性進一步進行評價，為黃連木葉多酚應用和開發(fā)提供理論基礎，同時也為提高能源林的經(jīng)濟效益進行有益探索。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

黃連木葉片2012年8月份采集于合肥市郊區(qū)，采集后殺青處理并60℃烘干，粉碎過篩(直徑為0.25 mm)。-20℃保存。

提取試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。200～300目硅膠購自國藥集團。2，7二氯熒光素二乙酸(2，7-Dichlorofluorescein diacetate)，胡桃醌(Juglone)，1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)。

1.2 儀器與設備

Allegra X-22R 離心機(Sigma)，UV-2550型紫外線可見光光度計(SHIMADZU)，RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SZM45-B2體視顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 供試樣品的制備黃連木葉粗多酚提取參考張旋等方法[10]。粗多酚的純化參考Tang 等[11]的方法：稱40 g硅膠粒(200～300目)，在105℃干燥30 min。將硅膠粒轉移到100 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)浸泡30 min，濕裝柱法裝柱(2.5 cm/73 cm)。 將0.40 g粗多酚溶于5 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)，混勻后上樣，用200 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)進行洗脫，流速為1秒2滴，收集洗脫液1.50 mL每管，共150 mL。將收集洗脫液用福林酚法(Folin-Ciocalteau法)檢測樣品中的多酚，發(fā)現(xiàn)多酚主要集中從30 mL到120 mL洗脫液中，共收集90 mL，再用旋轉蒸發(fā)儀將其蒸干成粉末即得到黃連木葉純化多酚。

1.3.2 多酚含量測定采用福林酚法 (Folin-Ciocalteau法)[12]。單寧含量的測定參照李靜等[13]的方法。黃酮含量的測定參照裴詠萍等[14]的方法。DPPH法測定黃連木葉多酚清除自由基能力參考王晶等[15]的方法。 FRAP法測定黃連木葉多酚抗氧化活性參考Benzie等[16]的方法。

1.3.3 黃連木葉多酚提高線蟲存活率 參考Hsu等[17]的方法。將同步化L1期N2線蟲培育于S-液體培養(yǎng)基，加入0.50 mL 大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) OP50。然后分別加入不同濃度純化多酚(0，100，200 μg/mL)。20℃培育72 h，3300 r/min離心2 min。將線蟲轉移到250 μmol/L胡桃醌(Juglone)溶液中，20℃處理200 min，24 h后計數(shù)線蟲的存活率。重復3次。

1.3.4 黃連木葉多酚對線蟲體內(nèi)ROS的抑制效應

參考Hsu等[17]的方法。線蟲培養(yǎng)和樣品處理同1.3.3。將線蟲轉移到150 μmol/L 胡桃醌溶液中20℃處理1 h，M9離心洗滌2次。將線蟲轉移到10 μmol/L的2，7二氯熒光素二乙酸溶液，20℃處理30 min。隨機挑出線蟲放在載玻片上，5 mM鹽酸左旋咪唑(Levamisole) 麻醉，熒光體視顯微鏡觀察拍照(曝光時間4 s)。Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計分析線蟲熒光強度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計分析熒光強度，ANOVA法(SPASS 16.0)顯著性檢驗。選取P< 0.05為顯著水平，線性回歸方程計算IC50(為清除率達到50%時的樣品濃度)。樣品純化率=(A1-A0)/A0*100%。(A0為黃連木葉粗多酚成分的測定參數(shù)，A1為黃連木葉多酚成分的測定參數(shù))

2 結果與分析

2.1 黃連木葉粗多酚純化

本文采用二元洗脫法，并根據(jù)薄層層析預實驗結果篩選系統(tǒng)液以達到較好的多酚富集。黃連木葉粗多酚樣品0.4000 g經(jīng)過硅膠柱得到0.2330 g純化產(chǎn)物，純化得率為58.25%。

2.2 純化產(chǎn)物的多酚含量

采用Folin-Ciocalteau比色法測定黃連木葉多酚的多酚含量，以沒食子酸為對照品，其結果見表1。純化前后的總酚含量分別為0.8400 g和1.0125 g當量沒食子酸每克樣品，純化后多酚含量提高了20.54%。根據(jù)硅膠粒對不同極性物質具有不同吸附力能力，收集多酚含量高洗脫部分，從而使多酚類物質富集，與色素類等物質分離[18]。因此，經(jīng)過硅膠柱純化后酚類物質的含量得到提高。

2.3 純化產(chǎn)物的單寧含量

采用福林酚-丹尼斯法(Folin-Denis法)測定單寧含量，以單寧酸為對照品，其結果見表1。黃連木葉多酚純化前后的單寧含量分別為0.7575 g和0.8600 g當量單寧酸每克樣品，單寧含量提高了13.53%。通過硅膠柱純化后，黃連木葉提取物中酚類物質的含量提高，而單寧與多酚類物質的極性很接近，即和硅膠粒的吸附能力也差不多，因而在純化多酚類物質同時也在富集單寧。

表1 黃連木葉提取物純化前后總酚、單寧和總黃酮的含量

2.4 純化產(chǎn)物的黃酮含量

采用三氯化鋁法測定黃連木葉多酚中黃酮含量，以蘆丁為對照品，結果見表1。黃連木葉多酚純化前后的黃酮含量分別為0.1297 g和0.1453 g當量蘆丁每克樣品，黃酮提高12.03%。本文主要目的旨在提高提取物的多酚含量，未對不同性質的多酚成分進行分級分離。黃酮作為多酚的一部分，通過硅膠柱純化后，其含量自然也隨著黃連木葉純化產(chǎn)物中多酚類物質的含量增加而提高[19]。

圖1 維生素C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚對DPPH·清除作用

2.5 純化產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力

黃連木葉多酚純化產(chǎn)物對DPPH的清除能力見圖1。實驗結果表明，純化產(chǎn)物清除DPPH自由基能力強于黃連木葉粗多酚，也強于維生素C(Vitamin C)，但微弱于98%茶多酚。DPPH自由基清除率與酚類物質含量呈正相關，說明酚類物質在DPPH自由基清除過程中起到主要作用。黃連木多酚的清除能力沒有茶多酚強，可能由于純化后黃連木多酚的純度仍然沒有達到商品化茶多酚的純度。另外，DPPH自由基的清除率還與其中所含有酚類化合物的種類和極性有關，中等極性的酚類物質對DPPH自由基清除率較高。兩種提取物的清除能力差異也可能是所含酚類的極性不一樣導致的[20]。IC50(當50%DPPH自由基被清除時的試樣濃度)的結果見表2。茶多酚、維生素C、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚純化產(chǎn)物的IC50分別為2.75 mg/L、4.03 mg/L、3.57 mg/L和3.02 mg/L，結果表明黃連木葉多酚具有比較強的抗氧化能力。

表2 維生素 C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚IC50和 FRAP10

2.6 FRAP法測定黃連木葉多酚純化產(chǎn)物抗氧能力

圖2 FRAP法測定維生素C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚的FRAP值Fig 2 FRAP values of vitamin C, tea polyphenols，crude polyphenols and polyphenols of P. chinensis leaf

由圖2可知，用FRAP法測定的黃連木葉多酚抗氧活性具有明顯的劑量效應，純化多酚強于粗多酚和維生素C，但稍弱于純茶多酚。FRAP10(表10 μg/mL樣品濃度下FeSO4當量)結果見表2?？寡趸芰ε判蚪Y果為茶多酚0.22、黃連木葉多酚0.20、黃連木葉粗多酚0.17及維生素C 0.16 (mmolFeSO4/L當量)。FRAP法和DPPH法測定黃連木葉多酚抗氧活性弱于茶多酚，而強于黃連木葉粗多酚和維生素C結論是一致的，但是這兩種方法測得這4種物質的抗氧活性在強弱的順序上存在差異，可能與DPPH和Fe3+提供電子能力不同和這兩個物質還原能力不一樣以及實驗參數(shù)衡量的參考水準不一樣有關。

2.7 黃連木葉多酚純化產(chǎn)物對線蟲存活率的影響

黃連木葉多酚對胡桃醌處理后秀麗隱桿線蟲的存活率的影響見圖3。胡桃醌(Juglone) 能顯著升高線蟲體內(nèi)ROS[17]，并導致線蟲死亡。但是經(jīng)過黃連木葉多酚預處理后，線蟲的存活率顯著提高，說明黃連木葉多酚具有比較強的抗氧能力。ROS通常被認為是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性。過量的·0和·OH氧化細胞膜中不飽和脂肪酸引起脂質過氧化、交聯(lián)、聚合成脂褐素(一種難以消除的惰性廢物)，導致脂褐素堆積在細胞內(nèi)毒害細胞。同時也對核酸進行氧化和交聯(lián)，使發(fā)生斷裂、突變，從而嚴重影響蛋白質遺傳信息的正常轉錄和翻譯，阻止細胞內(nèi)物質和信息的傳遞，進而引起細胞調亡和機體衰老死亡效應[21]。而黃連木葉多酚能有效降低ROS損傷導致的線蟲死亡率。

圖3 黃連木葉多酚對線蟲存活率的影響

2.8 黃連木葉多酚純化產(chǎn)物影響線蟲體內(nèi)ROS水平

為了進一步驗證黃連木多酚對線蟲的保護作用與清除ROS直接相關。本文對黃連木葉多酚抑制線蟲細胞內(nèi)的ROS進行檢測，結果見圖4。線蟲經(jīng)過胡桃醌(Juglone)處理后產(chǎn)生高濃度ROS[22]，而不同濃度的黃連木多酚可以有效的抑制其體內(nèi)的ROS。因此，黃連木葉多酚具備開發(fā)成為新的天然抗氧化劑，并應用于食品、保健和醫(yī)藥產(chǎn)品領域。

a—陽性對照； b—50 μg/mL多酚預處理； c—100 μg/mL多酚預處理； d—200 μg/mL多酚預處理； e—抑制ROS統(tǒng)計結果。

圖4黃連木葉多酚對線蟲體內(nèi)ROS的抑制效應

Fig 4 The ROS inhibitory effect of polyphenols fromP.chinensisleaf

3 結論

黃連木葉粗多酚經(jīng)過硅膠柱純化后，其多酚、單寧、黃酮含量分別為1.0125 g當量沒食子酸每克樣品、0.8600 g當量單寧酸每克樣品和0.1453 g當量蘆丁每克樣品。與粗多酚相比多酚含量提高了20.54%，單寧含量提高了13.53%，黃酮含量提高了12.03%。因而硅膠柱色譜法對酚類是個很好的純化方法，而且通過體內(nèi)和體外抗氧化法測定表明隨著酚類含量的提高，抗氧化活性也顯著性提高。因而黃連木葉多酚具有抗氧化性，是很好的天然抗氧化劑，具有在食品、保健等多個領域應用的前景。

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