王立如，徐紹清，沈生初，施 佩，王忠華

(1. 浙江省慈溪市林特技術(shù)推廣中心，浙江 慈溪 315300； 2. 浙江萬里學(xué)院 生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315100)

馬褂木，又稱為鵝掌楸(LiriodendronchinenseSarg.)，為木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬樹種，是珍稀的第三紀(jì)孑遺樹。該屬目前僅存馬褂木和北美鵝掌楸(L.tulipifera)兩種[1]。在中國(guó)的12個(gè)省(區(qū))84縣(市)有天然分布[2]，被列入同級(jí)二級(jí)珍稀瀕危保護(hù)樹種[3]。另外還有中國(guó)著名林木育種學(xué)家葉培忠教授通過人工雜交方法育成的雜交馬褂木(L.chinense× L.tulipifera)[4]。

北美鵝掌楸為落葉喬木，樹高可達(dá)60 m，胸徑可達(dá)3.5 m以上[1]。該樹種綠樹濃蔭，葉形奇特，具有極高的觀賞價(jià)值。另外，該樹種材淡紅褐色，輕軟適中，紋理清晰，結(jié)構(gòu)細(xì)致，輕而強(qiáng)韌，硬度適中，是膠合板的理想原料，也是制家具、縫紉機(jī)板、收音機(jī)殼與室內(nèi)裝修的良材。

近20年來，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)鵝掌楸屬植物進(jìn)行了大量的研究。國(guó)外主要是對(duì)北美鵝掌楸進(jìn)行的研究相對(duì)比較深入，無論在表型性狀(果長(zhǎng)、葉形)、材性、生長(zhǎng)量等，還是在蛋白質(zhì)、DNA分子水平上都做了深入的研究[1，5]。國(guó)內(nèi)對(duì)于馬褂木的研究主要集中在地理分布特征[2，3]、生殖生物學(xué)[6，7]、交配系統(tǒng)[8]、遺傳結(jié)構(gòu)[9，10]、材性[11，12]、育種與繁殖[13-17]、光合作用[18，19]和病原菌[20]等方面。以DNA為基礎(chǔ)的多態(tài)性檢驗(yàn)是遺傳多樣性檢測(cè)的強(qiáng)有力工具，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是常用方法之一，簡(jiǎn)單、快速、靈敏。羅光佐等[21]利用RAPD標(biāo)記，對(duì)部分群體馬褂木的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。

本課題組自2000年開始引種鵝掌楸屬樹種，包括馬褂木、北美馬褂木、金邊馬褂木和雜交馬褂木等，其中金邊馬褂木是北美馬褂木的栽培品種。金葉馬褂木是2002年從金邊馬褂木的嫁接苗中發(fā)現(xiàn)的全葉為金黃色的芽變材料。目前存圃的8年生金葉馬褂木平均樹高11 m，胸徑12 cm，長(zhǎng)勢(shì)健壯。本研究以8年生金葉馬褂木、金邊馬褂木、北美馬褂木為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)金葉馬褂木的主要生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析，并結(jié)合RAPD技術(shù)進(jìn)行分子鑒定，為確認(rèn)金葉馬褂木的遺傳變異提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料分別為8年生金葉馬褂木、金邊馬褂木、北美馬褂木，樣品采自浙江省慈溪市白沙街道農(nóng)業(yè)園區(qū)馬褂木種植基地。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)特性調(diào)查

在金葉馬褂木等品種生長(zhǎng)初期開始，間隔一定時(shí)間用數(shù)顯游標(biāo)卡尺和直尺測(cè)量各品種在不同時(shí)期葉片的寬度、長(zhǎng)度，并以相機(jī)采集植株葉片圖像。用葉綠素測(cè)定儀SPAD-502(日本生產(chǎn))測(cè)定各品種在不同時(shí)期的葉綠素含量，進(jìn)行比較分析。

1.2.2 預(yù)處理

將新鮮材料洗凈擦干后剪碎，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的PVP提取液以及2%的β-巰基乙醇進(jìn)行快速研磨。研磨成均勻的糊狀后，取適量分裝入1.5 mL的Eppendorf管中，待用。

1.2.3 基因組DNA提取

3個(gè)品種的樣品基因組DNA的提取采用改良的CTAB法進(jìn)行[22]，其步驟如下：1)向上面待用的EP管中加入800 μL預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，混勻后65℃水浴1 h，12000 r/min離心15 min；2)取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕混勻，12000 r/min離心15 min，重復(fù)此步驟1次；3)取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入-20 ℃冰箱40 min，沉淀DNA；4)加入200 μL 70%乙醇洗滌DNA 2～3次；5)將1.5 mL Eppendorf管倒置于通風(fēng)柜里，使DNA盡量干燥；6)加入適量的TE，溶解DNA；7)置于4℃冰箱保存，備用。

1.2.4 DNA純度和濃度檢測(cè)

DNA 濃度與純度的定性檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳的方法。取5 μL DNA 樣品，在1%的瓊脂糖下電泳。DNA 濃度與純度的定量檢測(cè)采用紫外分光光度法，DNA 的紫外吸收峰在260 nm 波長(zhǎng)處。純的DNA 的OD260/OD280應(yīng)該≥1.8。

1.2.5 PCR擴(kuò)增

選用上海生物工程公司RAPD擴(kuò)增隨機(jī)引物，引物長(zhǎng)度10 bp，經(jīng)初步篩選后，選用12個(gè)隨機(jī)引物，引物名稱與序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物

本實(shí)驗(yàn)中，RAPD 反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共45個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.6 PCR產(chǎn)物電泳及顯色

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.2 %瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件為80 V穩(wěn)壓電泳1 h，溴酚蘭作電泳指示劑，緩沖液為1×TBE，紫外凝膠成像儀觀察，用凝膠成像設(shè)備攝像并通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker比較分析結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003 統(tǒng)計(jì)軟件分析和制圖，采用DPS軟件顯著性測(cè)定[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片大小變化

如圖1和圖2 所示，3個(gè)鵝掌楸屬品種葉片生長(zhǎng)發(fā)育過程基本相同，3月底開始萌發(fā)，至5月上旬，為鵝掌楸屬品種葉片增大期，5月中旬開始進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)期，6月8日金葉馬褂木、金邊馬褂木、北美馬褂木葉片寬度、長(zhǎng)度分別為13.14 cm/11.62 cm、13.21 cm/11.55 cm、13.85 cm/12.2 cm。由此表明3個(gè)鵝掌楸屬品種葉片大小差異不大，其中金葉馬褂木、金邊馬褂木葉片比北美馬褂木葉片略小。從圖1和圖2還可看出，在4月16日，北美馬褂木葉片長(zhǎng)度和寬度都顯著高于金葉馬褂木和金邊馬褂木，葉片長(zhǎng)度F﹡﹡=32.573≥F0.01=4.02，葉片寬度F﹡﹡=23.457≥F0.01=4.02，而后兩者差異不大。這與各品種的基因型差異有關(guān)。

圖1 金葉馬褂木葉片寬度變化

圖2 金葉馬褂木葉片長(zhǎng)度變化

2.2 葉片葉綠素含量和色澤變化

如圖3所示，3個(gè)鵝掌楸屬品種葉片葉綠素含量變化過程基本相同。即從萌芽展葉至5月上旬，3個(gè)鵝掌楸屬品種葉片的葉綠素含量都處于遞增期，5月中旬開始進(jìn)入穩(wěn)定期，5月20日達(dá)到最高值。從對(duì)三者的比較可看出，金葉馬褂木葉片葉綠素含量與金邊馬褂木葉片周邊部分葉綠素含量差異不大，而金葉馬褂木葉片葉綠素含量明顯少于金邊馬褂木葉片中間部分和北美馬褂木葉片的葉綠素含量，4月16日F**=611.677≥F0.01=3.96；4月24日F**=661.99≥F0.01=3.97；5月5日F**=325.476≥F0.01=3.96；5月9日F**=84.622≥F0.01=4.03；5月20日F**=62.399≥F0.01=4.01；6月8日F**=196.754≥F0.01=3.94，差異達(dá)到極顯著性水平。

圖3 金葉馬褂木葉綠素含量變化

A1—2013年4月11日金葉馬褂木葉色；A2—2013年4月11日金邊馬褂木葉色；B1—2013年4月16日金葉馬褂木葉色；B2—2013年4月16日金邊馬褂木葉色；C1—2013年4月24日金葉馬褂木葉色；C2—2013年4月24日金邊馬褂木葉色；D1—2013年5月9日金葉馬褂木葉色；D2—2013年5月9日金邊馬褂木葉色。

圖4金葉馬褂木與金邊馬褂木的葉色變化對(duì)比

Fig 4 The difference of leaf color changes between tulip tree with golden leaves and with golden edge

2.3 3個(gè)鵝掌楸屬品種的RAPD分子鑒定

在12個(gè)RAPD隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有2個(gè)RAPD引物OPO16和OPAU19在3個(gè)鵝掌楸屬品種中擴(kuò)增出差異性條帶(圖5)。由圖5可見，上述兩種引物在金葉馬褂木中擴(kuò)增出與北美馬褂木、金邊馬褂木不同的特異性條帶。因此，RAPD引物OPO16和OPAU19可初步作為區(qū)分金葉馬褂木與北美馬褂木、金邊馬褂木的DNA指紋標(biāo)記。

1～3泳道分別為北美馬褂木(1)、金葉馬褂木(2)和金邊馬褂木(3)樣品；M為標(biāo)記。

圖5 RAPD引物OPO16和OPAU19的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig 5 PCR amplification with primers OPO16 and OPAU19

3 結(jié)論與討論

鵝掌楸屬樹種樹形端正，葉形奇特，是優(yōu)美的庭蔭樹和行道樹種，其中馬褂木與懸鈴木(Platanus×acerifolia)、椴樹(Tiliasp.)、銀杏(Ginkgobiloba)、七葉樹(Aesculuschinensis)并稱“世界五大行道樹種”。花淡黃綠色，美而不艷，最宜植于園林中的安靜休息區(qū)的上。秋葉呈黃色，很美麗，可獨(dú)栽或群植，在江南自然風(fēng)景區(qū)中可與木荷(Schimasuperba)、山核桃(Caryacathayansis)、板栗(Castaneamollissima)等行混交林式種植。因其花形酷似郁金香(Tulipagesneriana)，故被稱為“中國(guó)的郁金香樹(Chinese Tulip Tree)”，是一種非常珍貴的盆景觀賞植物，對(duì)SO2等有毒氣體有抗性，可在大氣污染較嚴(yán)重的地區(qū)栽植。

本試驗(yàn)所選的金葉馬褂木是金邊馬褂木的芽變種，其葉片特性與后者有較大的區(qū)別，即全葉為金黃色。其葉片大小、發(fā)育狀況與金邊馬褂木類似，但葉片葉綠素含量明顯低于后者。由此表明，金葉馬褂木極有可能是一種新的馬褂木種質(zhì)資源。

RAPD技術(shù)可快速、高效地獲得許多個(gè)或基因型的多位點(diǎn)DNA序列多態(tài)性信息，是極其有效的DNA遺傳標(biāo)記系統(tǒng)之一。本試驗(yàn)采用該技術(shù)對(duì)金葉馬褂木進(jìn)行了初步的分子驗(yàn)證，已成功獲得了差異性標(biāo)記RAPD引物OPO16和OPAU19，為金葉馬褂木作為新的種質(zhì)提供了有力的分子證據(jù)。但RAPD技術(shù)的擴(kuò)增結(jié)果受到多種因素的影響，如模板DNA、Mg2+、Taq酶、引物以及dNTPs等[24]，因此有必要開展馬褂木RAPD分子鑒定技術(shù)的參數(shù)優(yōu)化研究，為馬褂木的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

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