楊君張艷王偉巧榮偉王省芬馬峙英

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071001；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)博士后科研流動(dòng)站，保定 071001）

黃萎病菌誘導(dǎo)海島棉酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建及評(píng)價(jià)

楊君1，2張艷1王偉巧1榮偉1王省芬1馬峙英1，2

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071001；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)博士后科研流動(dòng)站，保定 071001）

采用SMARTTMcDNA合成技術(shù)，通過同源重組方法構(gòu)建了海島棉Pima90-53經(jīng)強(qiáng)致病力黃萎病菌誘導(dǎo)的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)測定，文庫容量為2.82×106，滴度為5.02×108cfu/mL。菌落PCR顯示，重組到pGADT7-Rec載體上的cDNA片段大小集中在500-1 500 bp之間，重組率93.33%。該文庫完全可用于下一步互作蛋白篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件確定及抗病蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析。

黃萎病菌 海島棉 酵母雙雜交 cDNA文庫

棉花是全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。棉花黃萎病是一種毀滅性的病害，廣泛分布于我國乃至世界的各產(chǎn)棉區(qū)，嚴(yán)重威脅棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)，是當(dāng)前影響棉花生產(chǎn)的主要病害之一［1］。近年來，棉花基因組研究取得長足進(jìn)展，CottonGen（http：//www. cottongen.org）富集了來源于不同棉種的基因數(shù)據(jù)［2］；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所完成了棉花二倍體D基因組雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.）的測序

和注釋［3］；轉(zhuǎn)錄組測序揭示了不同棉花品種在多種因子誘導(dǎo)下的基因表達(dá)模式［4，5］。這些進(jìn)展為解析棉花纖維發(fā)育、抗病蟲、耐澇旱等分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

然而，蛋白質(zhì)作為基因功能的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，有其自身特有的表達(dá)規(guī)律和功能模式，基因序列和轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)信息并不足以揭示其在生物體內(nèi)的確切功能［6］。生命活動(dòng)的過程實(shí)質(zhì)上是蛋白在特定時(shí)空下的互作，大多數(shù)蛋白是通過與其它蛋白或配體進(jìn)行結(jié)合形成復(fù)合物來發(fā)揮功能，進(jìn)而調(diào)控生物學(xué)過程。植物受病原菌侵染后的抗病或感病反應(yīng)往往伴隨細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄重編程，即一些蛋白會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量、構(gòu)象、修飾等的變化，導(dǎo)致蛋白間的互作狀況發(fā)生改變，從而影響植物的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］。酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）被認(rèn)為是研究蛋白質(zhì)互作的一種非常有效的手段［8］，研究人員利用此技術(shù)完成了第一個(gè)植物蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖譜，即擬南芥（Arabidopsis thaliana）互作圖譜［9］。目前，近80%的蛋白質(zhì)互作研究都是利用酵母雙雜交體系完成的［10］。

抗黃萎病遺傳改良和抗病機(jī)制研究一直是棉花遺傳育種領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。構(gòu)建黃萎病菌（Verticillium dahliae）誘導(dǎo)的海島棉（Gossypium barbadense L.）酵母雙雜交cDNA文庫，應(yīng)用于篩選與已知抗病蛋白或黃萎病菌毒素（效應(yīng)子）的互作蛋白，不僅有助于已知抗病蛋白的功能注釋和受體識(shí)別蛋白的發(fā)現(xiàn)，而且還可為解析棉花抗黃萎病網(wǎng)絡(luò)和闡明抗病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本研究采用SMARTTMcDNA合成技術(shù)，通過同源重組方法構(gòu)建海島棉Pima90-53經(jīng)強(qiáng)致病力黃萎病菌誘導(dǎo)的酵母雙雜交cDNA文庫，旨在為幫助棉花基因功能注釋，并推動(dòng)抗病基因的發(fā)掘和抗病機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海島棉品種Pima90-53由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種研究室保存［11］。綠色熒光蛋白標(biāo)記的黃萎病菌Vd-gfp77由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院戴小楓研究員饋贈(zèng)，該病菌致病能力與Vd991相當(dāng)［12］。黃萎病菌臨西2-1株系為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，為強(qiáng)致病力菌系［13］。Plus植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PolyATtract?mRNA Isolation System IV購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System和YeastmakerTMYeast Transformation System 2購自Clontech公司；其他培養(yǎng)基及生化試劑等購自寶生物工程（大連）有限公司。引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉苗培育與菌系孢子制備 據(jù)參考文獻(xiàn)［4］，將棉苗培育于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度6 000 Lux，光照時(shí)間12 h，晝溫28℃，夜溫25℃，濕度40%；將4℃保存的黃萎病菌單孢菌系接種到PDA固體培養(yǎng)基上活化，再轉(zhuǎn)接到Czapek液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)（25℃，150 r/min）10 d，通過紗布過濾去除菌絲收集孢子。

1.2.2 接菌與組織取樣 利用血球計(jì)數(shù)板，將黃萎病菌孢子液濃度調(diào)至107個(gè)孢子/mL，對(duì)剛出現(xiàn)第一片真葉的棉苗進(jìn)行蘸根接菌。分別在接菌后1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96和120 h取棉苗幼根，無菌水清洗后用液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 組織顯微觀察與病菌分離 取黃萎病菌Vdgfp77侵染后的棉苗莖進(jìn)行徒手切片，于熒光顯微鏡下觀察維管束中病菌侵染進(jìn)程。按照常規(guī)組織分離法，將臨西2-1侵染的棉苗莖切割成長約0.3 cm的小段，置于PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)3 d后觀察病菌出現(xiàn)情況。

1.2.4 RNA提取與mRNA分離 在液氮中對(duì)保存的樣品進(jìn)行充分研磨，按照“Plus植物總RNA提取試劑盒”說明書進(jìn)行RNA提取操作。將提取的12個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品總RNA等量混合（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)30 μg），用PolyATtract?mRNA Isolation System IV分離純化mRNA，采用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。

1.2.5 cDNA合成與純化 mRNA作為模板，參照Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System說明書合成第一鏈cDNA及 ds cDNA。利用CHROMA SPINTMTE-400柱對(duì)dscDNA進(jìn)行分級(jí)分離純化。

1.2.6 酵母感受態(tài)細(xì)胞制備 應(yīng)用PEG（polyethylene glycol）/LiAc（醋酸鋰）法制備酵母菌Y187感受態(tài)細(xì)胞。具體操作按照 YeastmakerTMYeast Transformation System 2的說明進(jìn)行。

1.2.7 酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建 采用Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System試劑盒進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建。共轉(zhuǎn)化體系如下：20 μL（4 μg）dscDNA、6 μL（3 μg）線性化pGADT7-Rec、20 μL（200 μg）變性YeastmakerTMCarrier DNA及600 μL Y187感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞液（15 mL）涂布于直徑150 mm的SD/-Leu平板上，每板涂布菌液150 μL（共100個(gè)平板），30℃倒置培養(yǎng)，3-5 d后用Freezing Medium收集轉(zhuǎn)化子，按照每管1 mL分裝，保存于-80℃。

1.2.8 文庫容量、滴度、重組率和多態(tài)性分析 將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞液稀釋100倍后涂布于直徑100 mm的SD/-Leu平皿，每皿50 μL，共涂布3皿，30℃倒置培養(yǎng)3-4 d，統(tǒng)計(jì)平皿上的菌落數(shù)，從而計(jì)算文庫總的克隆數(shù)=每皿平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化體積（15 mL），即代表文庫容量。取收集后分裝的文庫菌液稀釋10 000倍后涂布于直徑100 mm的SD/-Leu平皿，每皿50 μL，共涂布3皿，30℃倒置培養(yǎng)3-4 d，統(tǒng)計(jì)平皿上的菌落數(shù)，從而計(jì)算文庫滴度（cfu/mL）=每皿平均菌落數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)。挑取平皿上的菌落進(jìn)行小量培養(yǎng)，用1.5 μL酵母菌液作模板，pGADT7-Rec載體通用篩選引物（5' primer：5'-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3'和3' primer：5'-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT-3'，可擴(kuò)增載體序列約300 bp）進(jìn)行菌落 PCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算文庫重組率（%）=陽性菌落數(shù)/檢測菌落總數(shù)×100%，并分析文庫多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1 海島棉建庫材料準(zhǔn)備

棉苗在溫、光、濕可控的條件下生長健壯，整齊一致，根系發(fā)達(dá)，且棉苗在無菌條件下免受其它雜菌和蟲害的影響，最大程度減少了環(huán)境因素對(duì)試驗(yàn)的影響（圖1-A）。為了能夠?qū)θ訒r(shí)間進(jìn)行確定，以黃萎病菌Vd-gfp77處理的棉苗為對(duì)照，結(jié)果顯示，接菌72 h后，棉苗根變?yōu)闇\褐色（圖1-B），下胚軸基部維管束中出現(xiàn)明亮的綠色熒光（圖1-C和圖1-D），并且棉苗均能分離出接種的病菌（圖1-E）。這說明接菌72 h足以保證病菌侵入棉苗維管束，即棉苗與黃萎病菌建立侵染關(guān)系。因此，本研究對(duì)棉苗取樣時(shí)，以接菌后72 h作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，外加96 h和120 h，以此共計(jì)12個(gè)時(shí)間點(diǎn)的材料用于后續(xù)文庫構(gòu)建。

圖1 海島棉材料準(zhǔn)備

圖2 棉苗根組織總RNA電泳檢測

2.2 總RNA提取和mRNA純化

提取黃萎病菌處理后12個(gè)時(shí)間點(diǎn)的棉苗幼根總RNA，如圖2所示，28S與18S rRNA條帶清楚，比值約為2，表明RNA完整度好，基本無降解；A260/A280在1.9-2.1之間，濃度為2-3 μg/μL，說明RNA無蛋白和DNA污染，濃度較高。將12份材料的等量RNA混合進(jìn)行mRNA的分離和純化，電泳檢測mRNA大小分布范圍在400-3 000 bp（圖3），濃度為320 ng/μL，A260/A280=1.92，表明mRNA的質(zhì)

量和純度較高，滿足建庫的要求。

圖3 mRNA純化

2.3 dscDNA合成及分級(jí)分離

應(yīng)用CDSIII（Oligo-dT Primer）和SMART III-modified oligo引物合成cDNA第一鏈，以之為模板采用LD-PCR（Long distance PCR），對(duì)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，最終經(jīng)過21個(gè)PCR循環(huán)獲得dscDNA。CHROMA SPINTMTE-400柱截留純化，最終收集4個(gè)泳道的dscDNA（圖4泳道6-9），混合后檢測片段長度集中于500-3 000 bp（圖5）。

圖4 cDNA分級(jí)分離

圖5 dscDNA電泳檢測

2.4 酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量評(píng)估

根據(jù)同源重組的原理，將合成的棉苗dscDNA和pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過SD/-Leu平板篩選，4 d后獲得陽性重組子（圖6-A）。統(tǒng)計(jì)酵母轉(zhuǎn)化液稀釋100倍后涂布獲得的重組子數(shù)目（圖6-B），計(jì)算文庫容量= 94（每皿平均克隆數(shù)）/ 50 μL×100×15×103μL = 2.82 × 106。取文庫菌液稀釋10 000倍后涂布（圖6-C），根據(jù)出現(xiàn)的重組子數(shù)目計(jì)算文庫滴度= 2 510（每皿平均菌落數(shù)）/0.05 mL×104= 5.02×108cfu/mL。隨機(jī)挑取60個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢測（部分結(jié)果見圖7），顯示重組到pGADT7-Rec載體上的cDNA片段大小集中在400-1 500 bp之間；陽性菌落數(shù)為56個(gè)，重組率= 93.33%。

圖6 文庫構(gòu)建與質(zhì)量評(píng)估

3 討論

生產(chǎn)上的棉花品種主要是陸地棉（Gossypium hirsutum L.），其對(duì)黃萎病基本表現(xiàn)為感病或耐病，還沒有高抗黃萎病的陸地棉品種。陸地棉中多為微效多基因抗病位點(diǎn)，受環(huán)境影響大，難以進(jìn)行基因聚合育種。眾多學(xué)者認(rèn)為海島棉和部分野生棉種中存在對(duì)黃萎病高抗或免疫的材料，并且抗性表現(xiàn)為單基因或少數(shù)主效基因控制［11，14，15］。此外，大量的研究表明受黃萎病菌脅迫后，在防御酶類、抗病及參與次生代謝合成相關(guān)基因的表達(dá)速率或表達(dá)量方面，抗病海島棉顯著高于感病陸地棉［4，16，17］。因此，本研究以高抗黃萎病的海島棉Pima90-53作為建庫材料。

棉花黃萎病是由黃萎病菌引起的土傳真菌維管束病害。在適宜條件下，黃萎病菌的微菌核或分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生菌絲侵入棉花根部，經(jīng)過皮層進(jìn)入導(dǎo)管并繁殖產(chǎn)生大量的菌絲和分生孢子，分生孢子隨導(dǎo)管中的液流上升而擴(kuò)散到整個(gè)植株。因而，根作為黃萎病菌侵入棉花的首要組織器官對(duì)于研究棉花

抗病機(jī)理更具有意義。雖然棉花抗黃萎病侵染機(jī)制還存在爭議，但可以肯定的是其抗病過程包括免疫識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病基因表達(dá)等［1］。為此，本研究以多達(dá)12個(gè)時(shí)間點(diǎn)的棉花根組織作為建庫材料，保證了文庫包含的抗病相關(guān)基因數(shù)量的最大化。

圖7 PCR檢測文庫插入片段

在過去的一年中，生物基因組測序呈現(xiàn)爆炸式增長，研究和注釋這些基因功能也就成了后續(xù)重要而緊迫的任務(wù)［18］。蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，研究已知功能蛋白質(zhì)和未知功能蛋白質(zhì)相互作用是揭示未知蛋白功能的重要手段之一。酵母雙雜交cDNA文庫技術(shù)具有研究成本較低、可以檢測到一些微弱的蛋白質(zhì)互作、在酵母細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證互作而無需純化蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前高通量篩選蛋白質(zhì)互作的主要方法［19］。目前，二倍體棉花——雷蒙德氏棉全基因組圖已繪制完成，預(yù)測出40 976個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因［3］。本研究所在課題組前期已構(gòu)建黃萎病菌誘導(dǎo)的海島棉Pima90-53全長cDNA文庫，獲得了23 126個(gè)Unigenes。雖然這些基因已通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）定位于各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝通路，但其在棉花細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際功能還有待驗(yàn)證和發(fā)掘［4］。因此，本研究構(gòu)建的黃萎病菌誘導(dǎo)下的棉花酵母雙雜交cDNA文庫，不僅有助于棉花基因功能注釋，還將推動(dòng)抗病基因的發(fā)掘和抗病機(jī)制的解析。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了海島棉Pima90-53經(jīng)強(qiáng)致病力黃萎病菌誘導(dǎo)的酵母雙雜交cDNA文庫。文庫容量為2.82×106，滴度為5.02×108cfu/mL，重組cDNA片段大小集中在500-1 500 bp之間，重組率93.33%。該文庫完全可用于下一步互作蛋白篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件確定及抗病蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction and Characterization of Yeast Two-Hybrid cDNA Library Derived from Roots of Gossypium barbadense Inoculated with Verticillium dahliae

Yang Jun1，2Zhang Yan1Wang Weiqiao1Rong Wei1Wang Xingfen1Ma Zhiying1，2
（1. North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry，Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei，Department of Agriculture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001；2. Postdoctoral Research Station of Crop Sciences，Hebei Agricultural University，Baoding 071001）

A yeast two-hybrid cDNA library derived from roots of Gossypium barbadense cv. Pima90-53 inoculated with severe virulence Verticillium dahliae was constructed based on SMARTTMtechnique and homologous recombination reaction. Detection of the library indicated that its capacity and titer were 2.82×106and 5.02×108cfu/mL, respectively. The result from colony PCR showed that the length of insert cDNA fragments ranged from 500 to 1 500 bp on average and the recombination rate was 93.33%. These results demonstrate that the library meets the demands of the standard cDNA library, which will be useful for screening interaction proteins, determining signal transduction components and analyzing the structure and function of disease-resistant proteins in the future.

Verticillium dahliae Gossypium barbadense Yeast two-hybrid cDNA library

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.017

2014-04-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301370），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301371），河北省博士后科研項(xiàng)目（冀人社字［2013］303號(hào)）

楊君，男，博士后，研究方向：棉花遺傳育種；E-mail：yang22181@163.com；張艷為并列第一作者

王省芬，博士，教授，研究方向：棉花遺傳育種；E-mail：cotton@hebau.edu.cn