王少杰王廿師迎春胡曉艷周濤

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193；2.北京市植物保護(hù)站，北京 100029；3.北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

應(yīng)用深度測序技術(shù)鑒定平菇球形病毒

王少杰1王廿1師迎春2胡曉艷3周濤1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193；2.北京市植物保護(hù)站，北京 100029；3.北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

旨在鑒定采集于北京順義的畸形平菇樣品中的病毒，提取總RNA，構(gòu)建小RNA庫，對(duì)小RNA庫進(jìn)行深度測序。測序結(jié)果表明，與平菇球形病毒（Oyster mushroom isometric virus，OMSV）基因組序列（NC_004560.1）匹配的小RNA共有3 075條，分布在OMSV基因組的不同位置，形成一些熱點(diǎn)區(qū)域。經(jīng)拼接，獲得了3條長度大于500個(gè)核苷酸的序列。根據(jù)其中覆蓋OMSV外殼蛋白（Coat protein，CP）基因的序列（seq22）中相對(duì)保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得cp基因部分序列。序列比對(duì)表明，其與OMSV相應(yīng)區(qū)域序列相似度為91%，證實(shí)了OMSV在畸形平菇樣品中的侵染。同時(shí)，將深度測序結(jié)果與現(xiàn)有4種siRNA預(yù)測軟件的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與軟件預(yù)測結(jié)果之間存在差異，討論了這一差異出現(xiàn)的原因。

平菇 深度測序 平菇球形病毒 小干擾RNA 重疊群

平菇（Pleurotus ostreatus），又名糙皮側(cè)耳，是我國中原地區(qū)種植量最大的食用菌之一［1］。在平菇菌種繁育、種植過程中會(huì)受到一些病毒侵染為害，導(dǎo)致平菇子實(shí)體畸形，嚴(yán)重時(shí)造成不發(fā)菇，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降［2］。目前，對(duì)食用菌等真菌中病毒的檢測、鑒定、新病毒的發(fā)現(xiàn)等通常采用提取雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）的方法，該方法所需樣品多，過程復(fù)雜，需經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)和優(yōu)化才能獲得高質(zhì)量的dsRNA用于序列測定，限制了相關(guān)領(lǐng)域的研究。

深度測序技術(shù)鑒定病毒是近幾年快速發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)［3］。運(yùn)用深度測序技術(shù)鑒定病毒的理論

基礎(chǔ)是RNA干擾機(jī)制。20世紀(jì)末，研究人員發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)某些RNA分子能夠通過某一特定機(jī)制降低相應(yīng)基因的表達(dá)水平，這一特定機(jī)制為RNA干擾機(jī)制［4］。RNA干擾作為寄主的一種防御機(jī)制，廣泛地參與到寄主對(duì)抗各種病原物侵染的過程中。在寄主與病毒的互作中，病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA被寄主的某些特殊的內(nèi)切核糖核酸酶切割成小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），這些siRNA引導(dǎo)寄主體內(nèi)AGRONAUTE蛋白沉默與上述siRNA序列互補(bǔ)的病毒RNA［5］。參與沉默病毒RNA的這種siRNA被稱為病毒衍生的小干擾RNA（virusderived small interfering RNA，vsiRNA），vsiRNA之間在序列上有重疊，因此可以被組裝成連續(xù)的片段，這些連續(xù)的片段與相應(yīng)病毒的序列相同或者相似［6，7］。將vsiRNA的上述特性與深度測序技術(shù)相結(jié)合后，即可應(yīng)用深度測序技術(shù)鑒定已知病毒及某些新病毒了［8-10］。這一鑒定病毒的方法適用于多種生物體內(nèi)多種病毒的鑒定［8，11］。

平菇球形病毒（Oyster mushroom spherical virus，OMSV）是一種侵染為害平菇的正單鏈RNA病毒，于2003年首先被韓國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并分離［12］。OMSV病毒顆粒為等軸球形，直徑約為27 nm，基因組全長約為5.7 kb，5'-末端沒有帽子結(jié)構(gòu)，3'-末端有多聚腺苷酸尾巴，編碼7個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。目前已知其中兩個(gè)ORF的編碼產(chǎn)物，分別為病毒的外殼蛋白（Coat Protein，CP）和RNA依 賴 性RNA聚 合 酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP），其他ORF編碼的氨基酸序列與GenBank中已知的氨基酸序列沒有同源性［2，12］。平菇被OMSV侵染后，出現(xiàn)菌絲退化、菌柄短粗等癥狀［12］，這些癥狀使平菇經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低，從而導(dǎo)致平菇種植業(yè)損失嚴(yán)重。檢測鑒定平菇球形病毒，特別是檢測平菇菌種是否攜帶該病毒，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。

本研究應(yīng)用深度測序技術(shù)，鑒定子實(shí)體表現(xiàn)畸形癥狀平菇樣品中的OMSV，并分析與OMSV序列匹配的siRNA的分布規(guī)律和拼接序列與參比序列的比對(duì)結(jié)果，旨在為其他種類的食用菌中的病毒檢測鑒定提供借鑒和參考，并為深入研究OMSV與平菇的互作過程提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

平菇樣品采集于北京市順義區(qū)。樣品表現(xiàn)癥狀為菌柄短粗，菌蓋褐化程度嚴(yán)重，子實(shí)體畸形變小，生長受到阻滯（圖1）。

圖1 疑似被病毒侵染的平菇

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和質(zhì)量檢測 采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ca#t. AM1560 Austin TX，US）并根據(jù)說明書進(jìn)行樣品總RNA的抽提純化，之后對(duì)抽提純化后的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.2.2 深度測序和序列拼接 委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行深度測序（illumina solexa，HiSeq 2500 System）。測序樣本文庫構(gòu)建時(shí)，按照“TruSeq Small RNA Sample Preparation Guide”對(duì)純化后的樣品總RNA依次進(jìn)行3'端接頭連接、5'端接頭連接，反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、cDNA純化等步驟，從而完成測序樣本文庫的構(gòu)建。測序后，篩選出與病毒庫序列匹配的siRNA，進(jìn)行預(yù)處理，去除siRNA兩側(cè)接頭序列和低質(zhì)量序列標(biāo)簽（reads）。隨后使用軟件Clc Genomics Workbench（CLC bio，版本6.5）進(jìn)行序列拼接，軟件運(yùn)行時(shí)長度參數(shù)設(shè)置為200，其他參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。siRNA序列信息上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫（序列號(hào)為SRR1395331）。

1.2.3 拼接序列比對(duì) 使用本地化的Blast軟件（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/ LATEST，版本號(hào)2.2.29），進(jìn)行拼接序列的比對(duì)，序列比對(duì)時(shí)所使用的數(shù)據(jù)庫為從NCBI網(wǎng)站（www. ncbi.nlm.nih.gov）下載的病毒數(shù)據(jù)庫（時(shí)間為2014年3月2日，共有1 498 320個(gè)條目，均以FASTA格式保存）。

1.2.4 vsiRNA及拼接序列seq22的分析 使用Microsoft office軟件，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，分析與OMSV序列（ID：NC_004560.1）匹配的siRNA在病毒基因組上的分布規(guī)律，以及拼接序列與OMSV序列的比對(duì)結(jié)果。

1.2.5 PCR驗(yàn)證 根據(jù)序列核酸比對(duì)結(jié)果，使用軟件DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）設(shè)計(jì)引物OMSV4910F：5'-TACCCCCCCAGGATCTCAAGCTTCT-3'和OMSV5556R：5'-TGAAAGCGCGTCCATCAGAACCATTC-3'，擴(kuò)增cp基因部分片段，預(yù)期產(chǎn)物大小為646 bp。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃起始變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離。使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根生化科技公司）回收相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物。回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體（大連寶生物工程公司），陽性克隆由北京華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測定。使用DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.6 深度測序的結(jié)果與預(yù)測軟件結(jié)果的比較 用4種siRNA預(yù) 測 軟 件（siDESIGN Center，http：// www.thermoscientificbio.com/design-center/；DSIR，http：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html；OptiRNA，http：//optirna.unl.edu/；WI siRNA Selection Program，http：//sirna.wi.mit.edu/）對(duì)OMSV基因組產(chǎn)生siRNA分布情況進(jìn)行預(yù)測，并將深度測序數(shù)據(jù)中與OMSV匹配的siRNA分布情況與軟件預(yù)測結(jié)果的分布情況進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 平菇樣品總RNA質(zhì)量

提取的平菇樣品總RNA經(jīng)過質(zhì)量檢測，A260/A280=2.08，符合分離小RNA和建立cDNA文庫的標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 平菇病害樣品總RNA質(zhì)檢信息

2.2 與OMSV序列匹配的 siRNA分析

對(duì)siRNA測序結(jié)果進(jìn)行分析，去除接頭序列和低質(zhì)量標(biāo)簽（reads），使用本地化BLAST與病毒基因庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與病毒序列匹配的siRNA有5 409條，其中有3 075條siRNA與OMSV的序列（ID：NC_004560.1）匹配。按照vsiRNA的來源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)由OMSV正鏈形成的siRNA有2 029條，占總數(shù)的66%；由OMSV互補(bǔ)鏈形成的siRNA有 1 046條，占總數(shù)的34%，即由病毒正負(fù)鏈產(chǎn)生的siRNA比例接近2∶1。

對(duì)5'端起始核苷酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以腺嘌呤核糖核苷酸（A）為起始核苷酸的siRNA有674個(gè)，占總數(shù)的22%；以胞嘧啶核糖核苷酸（C）為起始核苷酸的siRNA有1 073個(gè)，占總數(shù)的35%；以鳥嘌呤核糖核苷酸（G）為起始核苷酸的siRNA有666個(gè)，占總數(shù)的22%；以尿嘧啶核糖核苷酸（U）為起始核苷酸的siRNA有660，占總數(shù)的21%（圖2）。

圖2 5'端起始核苷酸不同的vsiRNA之間的比例

按照OMSV上ORF的分布情況進(jìn)行分析（以vsiRNA的5'端的起始位置作為分類標(biāo)準(zhǔn)），發(fā)現(xiàn)有編碼CP的區(qū)域產(chǎn)生了最多的vsiRNA，是產(chǎn)生vsiRNA的熱點(diǎn)區(qū)域（表2）。

2.3 與OMSV序列匹配的拼接序列分析

使用Clc Genomics Workbench軟件對(duì)與病毒序列匹配的siRNA進(jìn)行序列拼接，拼接序列經(jīng)過本地化的blast比對(duì)后，其中有3條拼接序列與OMSV序列（ID：NC_004560.1）匹配（表3），與OMSV序列匹配上的序列總長度為5 096 nt，占OMSV序列的88%。

選取長度最大的拼接序列seq22進(jìn)行詳細(xì)分析。Seq22長度為2 747 nt，與OMSV序列（NC_004560.1）的核酸序列相似度為79.69%。按ORF的分布情況，將seq22序列分成4個(gè)區(qū)域，這4個(gè)區(qū)域分別參與

編碼RDRP、14.5 kDa、CP和23 kDa 4種蛋白。

表2 vsiRNA在病毒基因組上的分布

表3 拼接序列與平菇球形病毒基因組的匹配及相似度

使用DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）軟件從核酸序列和氨基酸序列水平比對(duì)seq22和OMSV基因組序列（ID：NC_00-4560.1）對(duì)應(yīng)區(qū)域的相似性（表4）。比對(duì)結(jié)果表明，在編碼RDRP和CP的ORF區(qū)域，seq22與OMSV基因組參考序列核酸序列之間相似性較低，但氨基酸序列之間相似性較高；在編碼14.5 kD蛋白和23 kD蛋白的ORF區(qū)域，seq22與OMSV基因組參考序列核酸序列之間和氨基酸序列之間相似性均較低。

表4 拼接序列seq22與OMSV基因組序列相應(yīng)區(qū)域的核苷酸和氨基酸相似性對(duì)比

2.4 RT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)序列拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)引物OMSV4910F和OMSV5556R，利用RT-PCR擴(kuò)增cp基因部分序列（圖3）。經(jīng)測序和序列分析，該P(yáng)CR產(chǎn)物為OMSV的部分cp序列，與OMSV標(biāo)準(zhǔn)序列（ID：NC_004560.1）的cp基因核酸序列相似度為91%，與相應(yīng)拼接序列（seq22）的核酸序列相似度為99%。

圖3 OMSV cp基因PCR檢測電泳圖

2.5 深度測序與預(yù)測軟件分析siRNA分布的比較

將深度測序數(shù)據(jù)中與OMSV匹配的siRNA的分布情況與4種siRNA預(yù)測軟件（siDESIGN Center，http：//www.thermoscientificbio.com/designcenter/；DSIR，http：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR. html；OptiRNA，http：//optirna.unl.edu/；WI siRNA Selection Program，http：//sirna.wi.mit.edu/）的預(yù)測結(jié)果的分布情況進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，實(shí)際情況與預(yù)測結(jié)果存在較大差異（圖4），預(yù)測結(jié)果表明編碼RDRP的區(qū)域是siRNA產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū)域，而測序結(jié)果中編碼CP的區(qū)域是siRNA產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū)域。

圖4 預(yù)測軟件結(jié)果與深度測序結(jié)果的比較

3 討論

通過深度測序鑒定病毒是近幾年來快速發(fā)展的病毒鑒定新技術(shù)，已在多個(gè)物種中應(yīng)用。與常規(guī)鑒定病毒的技術(shù)（如PCR）相比，應(yīng)用深度測序技術(shù)鑒定病毒的方法（以下簡稱深度測序）具有一些優(yōu)勢，特別是在發(fā)現(xiàn)新病毒方面。深度測序可以病毒序列等信息未知的情況下，只需提取總RNA，分離siRNA，構(gòu)建文庫后進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對(duì)即可對(duì)某一或一群生物體內(nèi)的幾乎所有病毒進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和鑒定，靈敏度高，適用性強(qiáng)，獲得的信息豐富；缺點(diǎn)是操作過程復(fù)雜，技術(shù)要求高，成本高。而常規(guī)應(yīng)用PCR 和RT-PCR檢測和鑒定病毒的方法（以下簡稱RT-PCR）需要病毒的基因組部分序列，適用于研究比較清楚的病毒，檢測針對(duì)性強(qiáng)，一次反應(yīng)僅能檢測一種至多種病毒，如果病毒序列變異大，極易出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果，優(yōu)點(diǎn)是已經(jīng)普及，成本低。

目前，對(duì)食用菌病毒研究相對(duì)較少，可以利用的序列信息也較少。食用菌栽培生產(chǎn)中有多種不正常生長表現(xiàn)，多為子實(shí)體畸形或者不發(fā)菇。利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，如RT-PCR方法、酶聯(lián)免疫方法和提取雙鏈RNA的方法對(duì)病毒進(jìn)行檢測，由于序列特異性強(qiáng)、檢測靈敏度低等缺點(diǎn)，難以對(duì)食用菌病毒做到全面檢測和鑒定，特別是尚未有報(bào)道的病毒［13］。

由OMSV正鏈形成的vsiRNA與由OMSV基因組互補(bǔ)鏈形成的vsiRNA之間的比例為2∶1。鑒于OMSV為正單鏈RNA病毒，因此推測OMSV衍生出的雙鏈和自身單鏈均是vsiRNA的主要來源。這可能是由于OMSV的正單鏈RNA自身形成了較多的發(fā)卡等二級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，平菇中以堿基C為5'端起始核苷酸的vsiRNA數(shù)量明顯多于其他vsiRNA，這可能是由于RNA干擾過程中，起相關(guān)作用的酶具有偏好性的緣故。

經(jīng)過分析vsiRNA在OMSV序列上的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)編碼CP的區(qū)域是siRNA產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū)域。主要原因可能是因?yàn)樵搮^(qū)域產(chǎn)生的siRNA具有較高的沉默效率，也有可能是因?yàn)槠渌粗蛩亍榱俗C實(shí)這一推測，將深度測序數(shù)據(jù)中與OMSV匹配的siRNA的分布情況與4種siRNA預(yù)測軟件的預(yù)測結(jié)果的分布情況進(jìn)行比較，結(jié)果表明軟件預(yù)測RDRP區(qū)域?yàn)閟iRNA產(chǎn)生熱點(diǎn)區(qū)域，與深度測序結(jié)果差異較大。由于預(yù)測軟件的算法是主要基于靶向序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)［14-16］，因此可以推斷編碼CP的區(qū)域成為熱點(diǎn)區(qū)域的主要原因有可能是一級(jí)結(jié)構(gòu)以外的其他原因。這些原因有可能與功能有關(guān)，CP是在病毒與寄主互作中的重要因子，寄主的防御系統(tǒng)將沉默的重點(diǎn)區(qū)域設(shè)定為編碼CP的區(qū)域，有助于寄主抵御病毒。除了功能原因以外，二級(jí)結(jié)構(gòu)也有可能是形成熱點(diǎn)區(qū)域的重要原因［17，18］。

在分析拼接序列seq22的不同區(qū)域是否存在同義突變時(shí)，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)特殊區(qū)域，分別參與編碼14.5 kD蛋白和23 kD蛋白。與OMSV編碼RDRP、CP區(qū)域不同的是編碼14.5 kD蛋白和23 kD蛋白核酸序列的變異直接導(dǎo)致氨基酸序列的改變，這種改變有可能使得這些區(qū)域編碼的產(chǎn)物功能發(fā)生變化。因此這些區(qū)域編碼的產(chǎn)物有可能在病毒與環(huán)境的互

作中起重要作用［19，20］。但由于這兩個(gè)區(qū)域編碼的產(chǎn)物功能未知，仍有待于進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用深度測序技術(shù)鑒定了平菇樣品中的平菇球形病毒（OMSV），并使用RT-PCR的方法進(jìn)行了驗(yàn)證；利用生物信息學(xué)技術(shù)初步分析了與OMSV有關(guān)的siRNA在病毒基因組上的分布情況。

［1］陳玉梅.平菇高產(chǎn)高效栽培［J］.農(nóng)業(yè)知識(shí)：瓜果菜, 2013（8）：46-47.

［2］李彥鵬, 梁振普, 張小霞, 等.食用菌病毒研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2006, 22（8）：408-413.

［3］Kreuze JF, Perez A, Untiveros M, et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs：a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses［J］. Virology, 2009, 388（1）：1-7.

［4］Nambudiri VE, Widlund HR. Small Interfering RNA［J］. Journal of Investigative Dermatology, 2013, 133（12）：e15.

［5］Molloy S. Host response：RNAi：challenging the dogma［J］. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11（12）：820-820.

［6］Aliyari R, Wu Q, Li HW, et al. Mechanism of induction and suppression of antiviral immunity directed by virus-derived small RNAs in Drosophila［J］. Cell Host & Microbe, 2008, 4（4）：387-397.

［7］Donaire L, Wang Y, Gonzalez-Ibeas D, et al. Deep-sequencing of plant viral small RNAs reveals effective and widespread targeting of viral genomes［J］. Virology, 2009, 392（2）：203-214.

［8］Xu Y, Huang L, Wang Z, et al. Identification of Himetobi P virus in the small brown planthopper by deep sequencing and assembly of virus-derived small interfering RNAs［J］. Virus Research, 2014, 179：235-240.

［9］Wu Q, Luo Y, Lu R, et al. Virus discovery by deep sequencing and assembly of virus-derived small silencing RNAs［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107（4）：1606-1611.

［10］Wu Q, Wang Y, Cao M, et al. Homology-independent discovery of replicating pathogenic circular RNAs by deep sequencing and a new computational algorithm［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109（10）：3938-3943.

［11］Al Rwahnih M, Daubert S, Golino D, et al. Deep sequencing analysis of RNAs from a grapevine showing Syrah decline symptoms reveals a multiple virus infection that includes a novel virus［J］. Virology, 2009, 387（2）：395-401.

［12］Yu H, Lee J, Lee N, et al. Identification of three isometric viruses from Pleurotus ostreatus［J］. Journal Huazhong（Central China）Agricultural University, 2003, 23（1）：150-156.

［13］徐章逸, 邊銀丙.食用菌病毒病害研究進(jìn)展［J］.食用菌學(xué)報(bào), 2008, 15（3）：80-84.

［14］許德暉, 黃辰, 劉利英, 等.高效siRNA設(shè)計(jì)的研究進(jìn)展［J］.遺傳, 2006, 28（11）：1457-1461.

［15］徐寶林, 于大川, 高冬, 等. siRNA序列特征的RNA干擾效率預(yù)測的新方法［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：信息科學(xué)版, 2011, 29（5）：436-443.

［16］方翔, 曹以誠, 杜正平, 等. siRNA理性設(shè)計(jì)原理分析［J］.生命的化學(xué), 2007, 27（4）：344-346.

［17］Schubert S, Grünweller A, Erdmann VA, et al. Local RNA target structure influences siRNA efficacy：systematic analysis of intentionally designed binding regions［J］. Journal of Molecular Biology, 2005, 348（4）：883-893.

［18］Overhoff M, Alken M, Far RKK, et al. Local RNA target structure influences siRNA efficacy：a systematic global analysis［J］. Journal of Molecular Biology, 2005, 348（4）：871-881.

［19］Roossinck MJ. Mechanisms of plant virus evolution［J］. Annual Review of Phytopathology, 1997, 35（1）：191-209.

［20］Holland J, Spindler K, Horodyski F, et al. Rapid evolution of RNA genomes［J］. Science, 1982, 215（4540）：1577-1585.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Identification of Oyster Mushroom Spherical Virus in Pleurotus ostreatus by Deep Sequencing

Wang Shaojie1Wang Nian1Shi Yingchun2Hu Xiaoyan3Zhou Tao1
（1. College of Agriculture and Biotechnology，China Agriculture University，Beijing 100193；2. Beijing Plant Protection Station，Beijing 100029；3. Beijing Agricultural Technical Extension Station，Beijing 100029）

To identify viruses in malformed Pleurotus ostreatus samples collected in Shunyi district in Beijing, deep sequencing of small RNA from total RNA was performed. Consequently, there were 3 075 small interfering RNAs（siRNAs）pairing to the complete sequence of Oyster mushroom isometric virus（OMSV）（NC_004560.1）. These siRNAs were located in most regions on genome of OMSV, some of which formed hot-spots. By putting these siRNAs together, three contigs with length more than 500 nucleotides were assembled. According to the sequence of one of these contigs, seq22, a pair of primers was designed to amplify partial coat protein gene via RT-PCR. The results showed that cloned sequence was similar to the

equence and to the contig with identities of 91% and 99%, respectively. These results confirmed OMSV in the collected mushroom samples. Meanwhile, the related data acquired from deep sequencing was compared to the predicted siRNAs obtained by four softwares, showing that they were different from each other. The difference was discussed.

Pleurotus ostreatus Deep sequencing Oyster mushroom spherical virus siRNA Contig

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.014

2014-05-04

2013年食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)崗位專家工作經(jīng)費(fèi)（PXM2013_036203_000055）

王少杰，男，碩士研究生，研究方向：植物病毒；E-mail：wangshaojiestrong@163.com

周濤，男，副教授，研究方向：植物病毒；E-mail：taozhoucau@cau.edu.cn

師迎春，女，研究員，研究方向：蔬菜和食用菌病蟲害；E-mail：shiych@126.com