馬原菲 呂夢園 釗守梅 韓新燕

(浙江大學動物科學學院，農業(yè)部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，飼料科學研究所，杭州 310029)

人類基因組測序草圖的完成，標志著生命科學進入以基因組學、蛋白質組學和代謝組學等為標志的后基因組時代。盡管基因組的研究已經日趨完善，但是其研究只能提供蛋白質的某些一級結構，而蛋白質的高級結構，蛋白質的修飾、活性、定位和蛋白質間相互作用等信息卻少之又少。因此，對生命活動執(zhí)行者——蛋白質的研究成為重要一環(huán)，從而蛋白質組學應運而生。它旨在通過蛋白質水平上對細胞或機體基因表達的終產物進行定量和定性的研究，來揭示生命活動規(guī)律及基因表達調控機制。隨著人們科學研究的深入和蛋白質組學的蓬勃發(fā)展，動物科學研究也將迎來新的進展。目前，蛋白質組學技術已經應用于肉品質、蛋品質、乳蛋白等研究中，并得到了海量的信息，為更進一步深入研究奠定了基礎，但依然存在諸多問題。本文重點對近年來蛋白質組學在動物科學中的應用現狀予以了評析，并發(fā)現問題，提出對策和展望，旨在為畜牧科學研究和生產提供借鑒。

1 蛋白質組學及其技術

根據 Swinbanks［1］和 Kahu［2］的報道，1994 年Marc Wilkins首先提出蛋白質組的概念，并最初定義為一個基因所表達的蛋白質。目前，蛋白質組準確化和完整化的定義是一個已知的細胞或組織在某一特定時刻所含有的所有亞基和修飾的蛋白質。因此，我們不難看出，蛋白質組學就是對生物體在蛋白質水平定量、動態(tài)、相互作用、整體性的全面研究，來識別及鑒定一個細胞或組織所表達的全部蛋白質及它們的表達模式和表達規(guī)律的一門學科。其主要內容包括:1)結構蛋白質組學，即對蛋白質組組成的研究。2)功能蛋白質組學，主要是比較蛋白質組學，它致力于比較、分析發(fā)生變化的生理條件下蛋白質組所發(fā)生的變化［3］。3)蛋白質組學支撐技術平臺和生物信息學研究。

1975年建立的雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)技術和 20世紀 80年代末Ferm 等［4］和 Tanaka 等［5］發(fā)明的質譜(mass spec-trum，MS)分析方法推動了蛋白質組學的發(fā)展。經過近10年的探索在技術上取得了重要進步，其中主要包括蛋白質分離和鑒定2個關鍵步驟。目前，蛋白質組分離技術主要有2-DE、兩維/多維分離、蛋白質芯片技術等。蛋白質組的鑒定技術主要有生物質譜、高效液相色譜、酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示技術等。在蛋白質鑒定上主要有2種路線:第1種是傳統(tǒng)的2-DE蛋白質分離、膠內酶解與MS鑒定相結合的方法，這也是最常見的一種，與該路線最匹配的是基質輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)類型的質譜;第2種路線是液相色譜與電噴霧電離質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS/MS)的方法對蛋白質復合物進行研究。除此之外，在蛋白質定量研究方面，目前的手段都有一定的使用范圍，同位素相對標記與絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQTM)技術已經成為十分成熟可靠的差異表達蛋白質的分析手段。蛋白質組學技術正向著高自動化、高分辨率、高通量的方向發(fā)展。

2 蛋白質組學在動物科學上的應用

2.1 肉品質研究

一些研究者致力于用蛋白質組學來描述骨骼肌中蛋白質的種類。Bouley等［6］利用2-DE和MS技術構建了牛的半腿肌蛋白質表達譜，檢測到500個可重復的蛋白質點，后來采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)的方法成功鑒定了其中 129個蛋白質點。Hatam等［7］用iTRAQTM技術對豬骨骼肌蛋白質表達譜進行了分析，共鑒定了542個蛋白質，并對鑒定的蛋白質表達譜進行亞細胞定位分類分析和對性別和營養(yǎng)因素引起的骨骼肌蛋白質組變化進行了分析。有些研究還對骨骼肌的不同發(fā)育時期蛋白質表達差異做了鑒定［8－9］，為研究肌肉形成和發(fā)育以及肌間分化奠定了基礎。

同時，肉的品質(嫩度、風味、持水力等)也是眾多動物科學學者關注的焦點。一方面研究是品種和年齡對肉質的影響:Park等［10］運用2-DE技術在韓國本土黑豬研究中，發(fā)現了肌動蛋白α1與嫩度有一定相關性。黃曉毅［11］研究結果表明，金華豬宰后肉品的持水性能、貨架壽命、肌肉組織總抗氧化能力顯著高于杜×長×大豬肉，并發(fā)現與其熱休克蛋白及肌間線蛋白高表達有關。Kristin等［12］分別將 6、9、12月齡的純種挪威長白豬和杜洛克豬屠宰，取大腿內收肌進行蛋白質組學分析，在分析的1 125個蛋白質點中，94個是因為品種引起的變化，41個是因為年齡不同引起的變化。這說明不同的品種和年齡間存在不同的代謝變化和肌肉組成。Mach等［13］也對5種不同品種豬的2部分肌肉進行了比較蛋白質組學分析。

另一方面研究是屠宰后蛋白質的變化:法國學者Lametsch等［14］首先將蛋白質組學應用于豬宰后肌肉組織變化研究中。對豬肌肉組織宰后0～48 h的蛋白質表達譜變化進行比對分析，發(fā)現了15個豐度隨時間而改變的蛋白質點(這些肌肉蛋白質從5～200 ku不等，pH在4～9)。其中12個蛋白質點的豐度隨時間而遞增，3個蛋白質點的豐度隨時間而遞減。隨后的研究發(fā)現，26種蛋白質與嫩度相關，這些蛋白質被鑒定為肌球蛋白重鏈(MHC)、肌球蛋白輕鏈Ⅰ、肌球蛋白輕鏈Ⅱ等片段，并最終確定了可作為肉質標記的20多種蛋白質［15－16］。在這些標記蛋白質中，發(fā)現肌動蛋白和肌球蛋白重鏈與肌肉的剪切力之間存在顯著相關。而Hwang等［17］指出局限于現有的研究，對于肉質到底與哪些蛋白質有線性直接的關聯機制還難以下定論。但也發(fā)現肌動蛋白及其相關多肽、肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白、ATP合成酶、熱休克蛋白27(HSP27)等蛋白質可以作為肉品質的標記。同時，Jia等［18］在分析宰后牛背最長肌代謝蛋白質組成變化中發(fā)現有25個蛋白質點發(fā)生了變化，并揭示了代謝蛋白和應激蛋白在宰后呈上調表達。Promeyrat等［19］發(fā)現含鐵蛋白和抗氧化相關蛋白是蛋白質氧化的潛在標記，并提到如果將蛋白質組學技術延伸到探究硫醇基官能、芳香族氨基酸和脂質等氧化相關物質，可能會更深入地在組織和細胞水平揭示氧化應激的機制，從而更有效地控制肉品質。當然，也有學者研究表明家禽PSE肉［即肉色灰白(pale)、肉質松軟(soft)、有滲出物(exudative)］綜合征可能與蛋白質的改變有直接關系［20］。但目前對于具體是哪些蛋白質發(fā)生了改變以及這些蛋白質如何被修飾還知之甚少。除此，宰后貯藏過程中鈣蛋白酶系統(tǒng)對肌纖維蛋白的降解起著重要作用，影響肉的嫩度［21－22］。

肉品質受營養(yǎng)、遺傳和環(huán)境等共同作用，但是其內在的分子機制人們尚認識不夠。蛋白質組學技術為肉品質科學的研究開辟了一條新的思路。利用蛋白質組學技術可以尋找、篩選并鑒定與肉質有關的蛋白質，有望憑借蛋白質組學揭示肉品質形成機制及其與嫩度、風味、持水性的關系。

2.2 乳品質研究

首先，人們對乳蛋白質組成進行了探究。所有物種的乳蛋白質都是以少數幾種蛋白質為主要組分。但由于翻譯后的修飾和遺傳變異，使得蛋白質組變成了一個復雜的體系。所以乳蛋白的組成復雜也為動物科學研究提出了難題，目前Galvani等［23－24］和 Yamada 等［25］分別檢測了高豐度和低豐度乳蛋白質，并成功檢測出一部分低豐度乳蛋白質。更進一步，楊永新等［26］提取低、中、高體細胞數和臨床乳房炎的牛乳蛋白質，分析了不同體細胞數牛乳中乳蛋白質的表達變化。結果顯示，牛乳酪蛋白質的水解程度隨著體細胞數的增加而增加，至嚴重臨床乳房炎時牛乳中酪蛋白質幾乎全部水解而乳清蛋白質急劇增加。

其次，胎次和泌乳階段也是影響乳蛋白質組成的重要因素。張樂穎等［27］利用LC-MS方法分析了不同胎次不同泌乳階段奶中乳蛋白質表達圖譜，與初產奶牛第1天乳蛋白質表達模式相比，第3胎第1天乳蛋白質表達圖譜中表達量上調的有4種蛋白質，但第2胎第21天乳蛋白質表達模式無顯著差異。差異表達的乳蛋白質包括免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白 M(IgM)、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)和白蛋白(albumin，ALB)。從而為揭示胎次和泌乳階段影響乳蛋白質表達的機制奠定了基礎。采用iTRAQTM技術，將分娩后第7天的乳脂肪球膜蛋白表達模式與第1天分析比較，Reinhardt等［28］發(fā)現包括嗜乳脂蛋白、黃嘌呤脫氫酶、脂肪酸結合蛋白等26種蛋白質的表達量上調，阿樸脂蛋白Al等19種蛋白質的表達下調，說明泌乳階段影響了乳蛋白質組成。

通過飼喂量或營養(yǎng)物質改變乳蛋白質組成，一直是值得研究的方面。Yang等［29］采用2DEMS技術，用D－亞麻酸灌注泌乳奶牛十二指腸，研究其灌注量對乳蛋白質組成的影響，發(fā)現當灌注量為0～200 g/d時乳蛋白質組成無變化。當灌注量上升到 400 g/d時，β－酪蛋白 A2、αs1－酪蛋白變異體和ALB含量上升，說明高劑量的D－亞麻酸可引起奶牛十二指腸代謝應激從而改變乳蛋白質組成。對產前奶牛補充用維生素AD3E(V-AD3E)，利用2-DE和LC-MS相結合技術對奶牛乳蛋白組成進行分析，結果發(fā)現V-AD3E參與了乳蛋白的合成，提高了初乳中IgG和ALB的含量，并且發(fā)現它們的表達量在產后第1天的乳中也上調，但對產后第21天的乳蛋白質表達量沒有影響［30］。楊永新等［31］研究了精粗分飼與全混合日糧的飼喂方式對牛乳蛋白質組成的影響，發(fā)現飼喂方式對牛奶中主要蛋白質表達沒有顯著影響。這些都為飼糧因素對乳蛋白質表達的影響機制研究提供了一定的參考。

2.3 蛋品質研究

雞蛋是胚胎體外發(fā)育的所有營養(yǎng)來源和保護屏障，也是人體的必需食品。2006年以來，國內外多位蛋白質組學研究領域專家相繼發(fā)表論文，對蛋殼、蛋清和蛋黃中全體蛋白質組分進行了鑒定和描述，最終在酸溶性蛋殼基質中發(fā)現了520種蛋白質［32］;在蛋清和蛋黃中分別鑒定了 165和255 種蛋白質［33－34］;在蛋黃膜中發(fā)現了 137 種蛋白質［35］。

雖然在雞蛋中發(fā)現了如此多的蛋白質，但對于這些蛋白質的具體功能大都還停留在預測階段。雞蛋中蛋白質也受多種因素的影響，比如孵化條件、飼養(yǎng)飼糧、儲藏條件等。Qiu等［36］對孵化早期的蛋清蛋白質進行分析，發(fā)現有8種蛋白質在孵化過程中豐度發(fā)生了顯著的變化，并確定了30個蛋白質點，并發(fā)現存在受溫度調控的蛋清蛋白質與轉錄因子間的相互作用。Wang等［37］對傳統(tǒng)白殼雞蛋、傳統(tǒng)褐殼雞蛋、葉黃素飼養(yǎng)的雞蛋、有機雞蛋等6種雞蛋蛋清進行差異蛋白質組分析，發(fā)現6種雞蛋間有19種蛋白質豐度存在顯著差異，并提出品種不同，雞蛋蛋白質豐度存在差異，蛋白質不存在差異。Dileep等［38］發(fā)現了雞蛋在儲藏期間蛋清蛋白質組學的變化，指出儲藏期間蛋清中不同蛋白質的豐度發(fā)生不同變化，這些變化與蛋清的稀薄化有關。

雖然雞蛋中被鑒定的蛋白質數量已經大幅提高，但對其實際數量以及不同部位新的蛋白質的探索仍將繼續(xù)。不同飼糧和孵化條件改變對雞蛋蛋白質的影響也將是研究的重點。

2.4 其他方面研究

動物機體的代謝由眾多mRNA分子表達和密碼蛋白質相互作用參與。本質上，mRNA水平的改變將導致蛋白質的改變，由于翻譯與轉錄豐度間無明顯相關性，所以二者改變不是平行對等的。同時蛋白質能夠動態(tài)地反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)，所以蛋白質組研究對科學研究具有更大的意義。例如在不同生理條件和營養(yǎng)條件下，利用蛋白質組學研究技術，可以探討機體蛋白質的變化。除此，蛋白質組學也可以深入而全面地探討動物生長發(fā)育的機制。并且研究一些營養(yǎng)物質和生理調控物質對蛋白質組的影響，尋找反映動物機體營養(yǎng)代謝狀況靈敏而特異的標記，揭示營養(yǎng)調控機制也一直是動物科學家孜孜以求的目標。

最近幾年，運用蛋白質組學技術探究添加微量元素對機體代謝的影響和腸道健康成為研究的熱點。王曉秋等［39］利用差異蛋白質組學，發(fā)現與對照組相比，高鋅組中有22個蛋白質點表達量上調，其中11個蛋白質點為特異性表達;有22個蛋白質點表達量下調，其中16個蛋白質點特異性消失。主要差異表達蛋白質涉及到能量代謝相關通路、氧化應激相關通路和增殖凋亡相關通路，這些結果證實了氧化鋅在一定程度上減緩斷奶所引起的腸道上皮細胞氧化應激狀況，改善腸道形態(tài)和健康。而在腸道健康方面，包括由腸道菌群改變引起腸道蛋白質表達差異［40－41］、飼喂不同蛋白質飼糧引起腸道蛋白質表達差異［42］等。

3 面臨的挑戰(zhàn)及對策

首先，蛋白質組學技術目前仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。一是細胞的生命活動是通過各種蛋白質來實現的一種動態(tài)過程。在不同的細胞周期、分化階段、生長的營養(yǎng)狀況以及環(huán)境條件等，機體蛋白質都會發(fā)生變化而且差異顯著。同時，氨基酸殘基數量太多，又加上蛋白質有復雜的翻譯和修飾，給分離分析帶來許多困難。面對這些問題，需要發(fā)展并選用更精準分離技術的同時，加大所研究樣本的數量，排除個體間差異，找出群體間差異。二是一般有重要功能的蛋白質的含量是非常少的，蛋白質不能像基因一樣在體外擴增，所以少量的蛋白質可能檢測不到。由此看來，面對眾多具有研究意義的翻譯后修飾的蛋白質、多肽的分析及低豐度蛋白質的檢測等，可采用樣品分級的方法(如亞細胞分級、親和分級和順序提取法等)和免疫學方法。順序提取法的原理是利用蛋白質溶解的差異性，使用不同溶解能力的溶液順序提取，從而使樣品可在雙向電泳中范圍內檢測［43］。免疫學方法是在電泳前加一些植物蛋白質的免疫吸附劑，然后通過低速離心將發(fā)生免疫吸附反應的植物蛋白質和免疫吸附劑的聯合體除去。這樣就大大降低了高豐度蛋白質的含量，從而減少了高豐度蛋白質對低豐度蛋白質的影響。這種方法已經在動物中使用。

其次，蛋白質組學在動物科學研究中的應用也存在諸多問題。一是由于受多方面因素的制約，蛋白質組學在動物科學上的應用只是涉及而不深入，研究結果大多分散冗雜，浮于表面，許多內在聯系都沒有揭露。因此，在以后的研究中，需要將相關聯的數據進行整合分析，并對差異表達蛋白質進行深入研究，使研究結果更有實際價值。二是研究的內容和方向大多相似，沒有新意，對低豐度蛋白質和亞細胞結構缺乏探索。因此，蛋白質組學雖是一項新穎有效的工具，但不可濫用，要找對切入點，才能達到科學研究的目的。三是飼養(yǎng)試驗中會有許多不確定因素，難免造成誤差。所以在設置對照組以及飼養(yǎng)群過程中，盡量減少誤差，為得到可靠數據奠定基礎。

4 小結

蛋白質組學的研究將在各個方面推動動物營養(yǎng)學的發(fā)展，并為畜牧生產提供理論依據。蛋白質組學是分析細胞蛋白質表達的一個新型、有效的工具。總之，蛋白質組學的研究將推動動物科學的發(fā)展，并為畜牧生產實際提供理論依據。我們希望在不久的將來，能夠運用蛋白質組學技術找到關于動物科學領域的更多信息，為動物科學家深入了解機體代謝機理和通過營養(yǎng)及其他途徑改善動物機體代謝提供依據。然而，我們必須銘記，蛋白質組只是一種分析工具而不是解決問題的唯一方法。因此，在科學研究過程中不一定對任何研究進行蛋白質組學分析，因為即使進行了蛋白質組學研究也未必能得出有效的結果。同時，我們必須在運用蛋白質組學技術的同時聯合其他技術，更加全面系統(tǒng)的分析原因，才能得到更準確更真實的數據。

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