席蕓，錢曉萍，劉寶瑞

(1. 東南大學醫(yī)學院，江蘇 南京 210009； 2. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210008)

抗腫瘤藥物細胞毒殺傷作用無選擇性，且在體內(nèi)環(huán)境中難以保持穩(wěn)定的有效濃度。將抗腫瘤藥物通過載體靶向運送至腫瘤組織后再釋放是降低藥物毒副作用、減少用藥劑量、增強藥物在局部藥效的最佳辦法?？茖W家們嘗試過多種方法提取或仿生合成紅細胞膜用于載藥系統(tǒng)，但面臨生物相容性、生物安全性等問題，于是采用紅細胞直接作為載體的想法應運而生[1]。自體血液中分離的紅細胞具有類似脂質體作為藥物載體的潛能，不同載藥方式處理和修飾后建立起來的載體紅細胞有較好的安全性、有效性和易耐受性。此外，紅細胞經(jīng)修飾后可具有不同的靶向性，應用于抗腫瘤藥物的運輸可以提高其腫瘤局部治療的效果。

1 紅細胞作為藥物載體的優(yōu)勢

紅細胞除了運送氧氣、二氧化碳之外還有抗原識別能力，能調(diào)節(jié)體內(nèi)多種免疫殺傷細胞的活性，同時能識別、黏附和提呈腫瘤抗原。其作為一種藥物載體除了有提高治療效果、減小毒副作用[2]外，還具有以下一些獨特的優(yōu)越性[3- 4]。

1.1 易獲得和體內(nèi)循環(huán)生存時間長

正常人體血液中的紅細胞數(shù)量多達(3.5～5)×1012L-1，占所有血細胞的99 %以上。而且載體紅細胞空載時在體內(nèi)循環(huán)中的壽命平均為89～131d，半衰期為19～29d，接近于正常紅細胞的值。因此，血液學指標較好的腫瘤患者可以利用自身的紅細胞作為藥物載體而不影響其健康狀況。同時對紅細胞或藥物進行修飾，通過一些化學鍵或靜電作用改變藥物與紅細胞的連接方式，還可以使藥物釋放達到理想的速率[5]。

1.2 可觀的表面積、體積和生物靶向性

紅細胞膜面積約為160μm2，體積約為90μm3，為載體修飾和藥物包載提供了大量的位置和空間[6]。衰老、變性的紅細胞主要在機體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)被清除，這雖然可以被設計成脾、肝靶向的藥物載體，但并不能發(fā)揮紅細胞作為生物載體長循環(huán)的優(yōu)勢，但是通過對紅細胞的修飾可使載體紅細胞將藥物選擇性地定向于靶部位[7]。

1.3 安全性和耐受性

與其他藥物載體相比，紅細胞作為機體自身的組成部分具有其他人工合成的藥物載體無法比擬的生物相容性和生物可降解性，應用患者自身的紅細胞還可以避免免疫系統(tǒng)的干擾。紅細胞膜為半透膜，對載入藥物的緩慢釋放可以使藥物在循環(huán)中維持穩(wěn)定的有效濃度，可以減少用藥量和給藥次數(shù)，同時安全性、耐受性也能顯著提高。

2 載藥方式

目前已研究出多種包載藥物的方法，主要分為細胞內(nèi)包埋和細胞表面吸附兩種途徑，將包有藥物的微球吸附于紅細胞表面是最近提出的載藥方式。

2.1 細胞內(nèi)包埋

當紅細胞外滲透壓為150mOsm·kg-1H2O(即溶血臨界點)時，紅細胞可逆性膨脹至原體積的125%，呈橢圓形，紅細胞膜上孔隙(D=20～50nm) 短暫開放，外界物質即可進入紅細胞，同時紅細胞內(nèi)的血紅蛋白部分逸出紅細胞；當紅細胞外滲透壓恢復至300mOsm·kg-1H2O時，紅細胞可以恢復原狀，膜上孔隙隨之關閉，外界物質即包封于紅細胞內(nèi)[7]。

2.2 表面吸附及修飾

紅細胞膜表面為載藥提供了大量的鏈接位置和空間，目前常用的結合方式有化學鍵結合(共價鍵或非共價鍵)、藥物作為配體與載體紅細胞上修飾的受體結合、在藥物上連接抗體結構與載體紅細胞表面固有的抗原結合[8]。表面吸附可以減少對載體紅細胞的損傷及生物相容性的影響，前藥的應用可以避免血漿中抑制因子對藥物的滅活。

2.3 載微球紅細胞

微球是最近發(fā)展起來的新型藥物載體，微球的控釋效果好但循環(huán)清除率高，而紅細胞載體易獲得、在循環(huán)中生存時間長，但控釋效果差，這樣兩者正好進行互補，使得載微球紅細胞在理論上有循環(huán)時間長、藥物釋放穩(wěn)定、藥物清除后對紅細胞無影響的優(yōu)點。

Elizabeth等[9]證實，直徑在100nm～1.1μm的微球可以吸附在紅細胞表面，并且不影響紅細胞的形態(tài)，且在24h內(nèi)較穩(wěn)定。體內(nèi)實驗證實，微球吸附于紅細胞表面后體內(nèi)循環(huán)時間從2h延長到12h，并且在微球被完全清除后被其黏附的紅細胞在體內(nèi)的循環(huán)并沒有受到影響。吸附和脫落方式研究結果顯示：(1) 血清中的調(diào)理素、補體等物質會影響微球與紅細胞的連接；(2) 連接方式(疏水鍵/共價鍵/靜電作用) 不同、直徑不同，導致體內(nèi)循環(huán)時間不同；(3) 脾臟主要作用于大顆粒，使微球從紅細胞上脫落，而肝臟主要作用于小顆粒，清除體內(nèi)的微球；(4) 細胞間相互作用、毛細血管壁的作用和血管內(nèi)剪切力是微球從紅細胞上脫落的主要作用因素，其中細胞間的相互作用最大。后續(xù)的體內(nèi)實驗證實，用聚乙二醇修飾載微球紅細胞能進一步降低微球的清除率，循環(huán)中微球被完全清除所需的時間從2d延長到7d以上。

最近，F(xiàn)an 等[10]成功地將低分子殼聚糖微球吸附于載體紅細胞表面，并且對紅細胞的功能及壽命沒有產(chǎn)生明顯的影響，為紅細胞- 低分子殼聚糖復合物成為血管內(nèi)藥物運輸系統(tǒng)奠定了基礎。

3 紅細胞的修飾與保護

為了增強載體紅細胞與藥物連接的穩(wěn)定性、控制藥物釋放、改善靶向性，對載體紅細胞進行修飾也是目前研究的熱點。

3.1 戊二醛

Marczak[8]經(jīng)一系列的實驗后認為用戊二醛修飾載體紅細胞可以達到以下目的：(1) 增加藥物穩(wěn)定性；(2) 增強載藥紅細胞體內(nèi)、體外的活性；(3) 使載藥紅細胞不被巨噬細胞“吞噬”；(4) 使包載的藥物與包膜連接，在連接鍵水解后藥物經(jīng)包膜緩釋，但戊二醛會影響載體紅細胞功能并使載體紅細胞壽命縮短而使其應用受阻。

3.2 DTSP/BS3

DTSP[3，3′- 二硫代雙(磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯)]和BS3(雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽) 都是一種Band 3(帶3蛋白) 交聯(lián)試劑。用Band 3交聯(lián)試劑修飾的載體紅細胞更易被巨噬細胞識別和吞噬(吞噬率從3 %提高到了11 %)，并且經(jīng)Band 3與巨噬細胞形成牢固連接[7]，但其生物安全性和生物相容性需要進一步認證。

3.3 磁化

磁化載體紅細胞是將有磁性的納米顆粒包埋入載體紅細胞或者吸附在載體紅細胞表面，再利用體外磁場作用引導，提高靶部位藥物濃度，降低抗腫瘤藥物對正常組織的毒副作用[11]。

3.4 免疫逃避保護

藥物長期與紅細胞接觸會使紅細胞生理結構發(fā)生改變，易過早地被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)識別，進而被吞噬細胞清除[11]。徐艷艷等[12]證實用海藻酸鈉- 聚賴氨酸- 海藻酸鈉微囊包裹紅細胞可保護其免受宿主免疫系統(tǒng)的排斥，且該囊膜具有一定的通透性，氧氣、葡萄糖等小分子物質能透過囊膜。用該囊膜包裹載藥的紅細胞可以在保證藥物穩(wěn)定釋放的同時發(fā)揮紅細胞作為生物載體長循環(huán)的優(yōu)勢，或許還能保護異體紅細胞載體逃避體內(nèi)免疫系統(tǒng)的排斥。

4 載體紅細胞在抗腫瘤藥物運輸方向的應用

目前能被載體紅細胞包載的物質有50多種，其中載L- 門冬酰胺酶紅細胞已經(jīng)應用于臨床治療急性淋巴細胞白血病[5]；部分細胞抑制劑、抗生素、激素、維生素、酶類和疫苗已經(jīng)成功地被載體紅細胞包載[2- 3，13]。

4.1 依托泊苷

Lotero等[7]建立了載依托泊苷(etoposide) 紅細胞，并進行了體內(nèi)實驗。用低滲透析等滲重封的方法包載，最大包載率為22%，細胞回收率為56.6 %。用BS3處理載體紅細胞能使巨噬細胞對載依托泊苷紅細胞的吞噬量從4 %提高到14 %，載依托泊苷紅細胞能使巨噬細胞內(nèi)(15.36±4.67)%的DNA骨架斷裂，而依托泊苷裸藥只能使巨噬細胞內(nèi)(9.0±2.65)%的DNA骨架斷裂，說明經(jīng)紅細胞包載后依托泊苷對巨噬細胞的毒性增強。

4.2 5- Aza- 2- dC

Caterina等[14]用病毒刺突融合糖蛋白修飾載體紅細胞包載5- Aza- 2- dC(5- 雜氮- 2′- 脫氧胞苷)，并用熒光染色觀察其作用于人子宮頸癌細胞(HeLa細胞)的過程：(1) 30min后載藥紅細胞開始與HeLa細胞連接；(2) 6h后大部分載藥紅細胞進入HeLa細胞的胞漿內(nèi)；(3) 12h后載藥紅細胞的膜開始與HeLa細胞的膜黏附，藥物釋放入腫瘤細胞內(nèi)；(4) 96h后大部分HeLa細胞出現(xiàn)了細胞凋亡晚期的典型微核形態(tài)。該實驗還證實，用HA病毒蛋白修飾載體紅細胞能通過與HeLa細胞的高效黏附增強藥物的生物利用度。

4.3 甲氨蝶呤

袁盛華等[15]對載體紅細胞包載甲氨蝶呤做了一系列的臨床前試驗。首先，用正交試驗確定了高滲法制備的最佳條件值，使載藥率提高到了41.58 %，并且證實該方法不改變載體紅細胞的免疫黏附性。接下來的體內(nèi)研究證實，甲氨蝶呤經(jīng)載體紅細胞包載后血藥濃度高峰從(13.6±3.7)mg·L-1下降到(2.7±1.2)mg·L-1，半衰期從(3.9±0.8)h延長到(13.5 ± 2.0)h，說明載體紅細胞對甲氨蝶呤有緩釋效應；在產(chǎn)生與裸藥相近的抑瘤作用的同時將荷瘤小鼠的8d存活率從50 %提高到87.5 %，而且對丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸轉氨酶、血清肌酸酐等生化指標的異常有明顯逆轉作用。彭麗華[16]也證實載甲氨蝶呤紅細胞相較于甲氨蝶呤裸藥能提高大鼠的生存能力，還能保護大鼠的肝腎功能。

4.4 長春新堿

施瑩等[17]對載體紅細胞包載長春新堿做了一系列臨床前研究。用改良低滲預膨脹法制得了穩(wěn)定的對載體紅細胞天然免疫活性無影響的載長春新堿紅細胞，平均載藥率高達(61.42±3.69) %，細胞平均回收率高達(90.61±4.95) %，高倍鏡下觀察載體紅細胞形態(tài)，比較包載前后均無明顯變化。體內(nèi)實驗證實，長春新堿載藥紅細胞組對小鼠移植瘤的抑制率為42.42 %，是單用長春新堿組的2.43倍，而且長春新堿載藥紅細胞組小鼠的體重增加也較單用長春新堿組更明顯，說明長春新堿經(jīng)載體紅細胞包載后不僅抗腫瘤效應增強，還減少了毒副作用；連續(xù)檢測小鼠血液、腫瘤、肝臟內(nèi)的藥物濃度可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)紅細胞包載后長春新堿在血中的半衰期達4.1h，是單用長春新堿組的2.68倍，并且靜脈輸注后72h內(nèi)長春新堿載藥紅細胞組在肝臟、腫瘤內(nèi)長春新堿的濃度高于單用長春新堿組，說明載體紅細胞對包載的長春新堿有緩釋作用，并且有肝臟、腫瘤靶向性。

5 結 語

用完整的細胞作為運輸載體的思路在載藥系統(tǒng)建立的研究中已產(chǎn)生多年[18]，且越來越多地被關注和研究，其中將患者自身的紅細胞作為藥物載體來減少化療藥物的毒副作用、延長藥物的作用時間、增強藥物的腫瘤局部作用效果是一種既簡單又安全的途徑。相較于納米載體，技術方法較易普及，且有更好的生物相容性和生物可降解性。但是腫瘤患者自身的紅細胞通常有某些結構和分子的改變影響其藥物運輸?shù)墓δ躘19]，海藻酸鈉- 聚賴氨酸- 海藻酸鈉微囊等技術使載體紅細胞的建立不局限于自身的紅細胞，使得該技術能被更廣泛地應用。對紅細胞載藥研究至今，科學家們雖然有很多重大的突破，同時也面臨著許多難題。如何能更好地控制載體紅細胞對所載藥物的釋放；通過各種修飾提高載體紅細胞的靶向性，增加載體紅細胞的靶向部位；使載藥過程和對載體紅細胞的修飾過程不影響載體紅細胞的結構、功能和生物相容性等這些問題都是值得我們?nèi)ミM一步探索的。對載藥紅細胞的研究大都只停留于臨床前的研究，只有少數(shù)幾種藥物進入了臨床應用，這其中缺乏資金支持、缺乏統(tǒng)一的標準認證等都是亟待解決的問題。接下來對紅細胞載藥的研究應更多地著重于向臨床的推廣，確定紅細胞載藥系統(tǒng)統(tǒng)一的安全性檢測標準；同時增加載體紅細胞的載藥種類，增強載體紅細胞的靶向性等都是科學家們接下來要努力的方向。

[1] HU C M，F(xiàn)ANG R H，ZHANG L.Erythrocyte- inspired delivery systems[J].Adv Healthc Mater，2012，1(5):537- 547．

[2] YANN G，F(xiàn)RANCOISE H，ROBERT F，et al.International seminar on the red blood cells as vehicles for drugs[J].Expert Opin Biol Ther，2012，12(1):127- 133．

[3] SZUMILO M.Erythrocytes- the new application in medicine[J].Pol Merkur Lekarski，2013，34(199):5- 8．

[4] MAGNANI M，PIERIGE F，ROSSI L.Erythrocytes as a novel delivery vehicle for biologics:from enzymes to nucleic acid- based therapeutics[J].Ther Deliv，2012，3(3):405- 414．

[5] GUTIERREZ M C，COLINO G C I，SAYALERO M M L，et al.Cell- based drug- delivery platforms[J].Ther Deliv，2012，3(1):25- 41．

[6] VLADIMIR R.Drug delivery by red blood cells:vascular carriers designed by Mother Nature[J].Expert Opin Drug Deliv，2010，7(4):403- 427．

[7] LOTERO L A，OLMOS G，DIEZ J C.Delivery to macrophages and toxic action of etoposide carried in mouse red blood cells[J].Biochim Biophys Acta，2003，1620(1- 3):160- 166．

[8] MARCZAK A.Fluorescence anisotropy of membrane fluidity probes in human erythrocytes incubated with anthracyclines and glutaraldehyde[J].Bioelectrochemistry，2009，74(2):236- 239.

[9] ELIZABETH C，SAMIR M.Prolonged circulation of large polymeric nanoparticles by non- covalent adsorption on erythrocytes[J].J Control Release，2004，100(2004):111- 119．

[10] FAN W，YAN W，XU Z，et al.Erythrocytes load of low molecular weight chitosan nanoparticles as a potential vascular drug delivery system[J].Colloid Surf.B- Biointerfaces ，2012，95(1):258- 265．

[11] 范聞，嚴微，徐祖順.新型紅細胞- 納米粒子載體系統(tǒng)的研究進展[J].膠體與聚合物，2011，49(4):187- 189．

[12] 徐艷艷，傅紅興，趙應征，等.載紅細胞海藻酸鈉- 聚賴氨酸一海藻酸鈉微囊的制備及質量評價[J].溫州醫(yī)學院學報，2010，40(5):465- 468．

[13] GAMAL E I，MOHAMED F，F(xiàn)ARS K.Characterization of human erythrocytes as potential carrier for pravastatin:aninvitrostudy[J].Int J Med Sci，2011，8(3):222- 230．

[14] CATERINA C，MONIA T，ILARIA N，et al.Newly engineered magnetic erythrocytes for sustained and targeted delivery of anti- cancer therapeutic compounds[J].PLoS ONE，2011 ，6(2):e171321- e171329．

[15] 袁盛華，汪浩，葛衛(wèi)紅，等.甲氨蝶呤紅細胞載體對肝癌模型大鼠肝腎功能的保護作用[J].藥學與臨床研究，2010，18(2):164- 167．

[16] 彭麗華.甲氨碟呤紅細胞載體對肝癌模型大鼠肝腎功能影響觀察[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2012，10(1):149．

[17] 施瑩，錢寶華，郭峰，等.長春新堿載體紅細胞體內(nèi)代謝分布的初步研究[J].臨床血液學雜志，2008，21(8):411- 414．

[18] 崔鳳鳴.骨髓間充質干細胞作為胰腺癌基因治療載體的實驗研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學，2011，39(4):387- 392.

[19] 伍金華，周克元.乳腺癌患者紅細胞膜n- 6/n- 3多不飽和脂肪酸比率檢測的臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志，2012，20(7):512- 514，543.