張 輝，鄭榮琴，錢孝賢，郝寶順，張成喜

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1.超聲科，中山大學(xué)超聲與介入治療研究所，2.心內(nèi)科，廣東廣州 510630)

多柔比星對(duì)新西蘭大白兔心功能及心肌血管緊張素Ⅱ水平的影響

張 輝1，鄭榮琴1，錢孝賢2，郝寶順2，張成喜2

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1.超聲科，中山大學(xué)超聲與介入治療研究所，2.心內(nèi)科，廣東廣州 510630)

目的 研究多柔比星對(duì)兔的心肌毒性作用及其機(jī)制。方法 雄性健康新西蘭大白兔靜脈注射多柔比星2 mg·kg－1,每周1次,連續(xù)8周,分別于給藥前、給藥期間及停藥后8周內(nèi)每隔7 d采用超聲檢測(cè)射血分?jǐn)?shù)和心導(dǎo)管檢測(cè)左心室壓力最大上升速率(＋dp/dtmax),HE染色及透射電鏡觀察心肌組織形態(tài)及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),TUNEL法測(cè)定凋亡指數(shù),Western蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平。結(jié)果給藥7次后,射血分?jǐn)?shù)明顯下降(P＜0.05),8次后下降至谷底；給藥3次后,＋dp/dtmax明顯降低(P＜0.05), 8次后的第1周時(shí)達(dá)到最低,之后逐步上升,停藥后第6周不再出現(xiàn)明顯上升,但未恢復(fù)至正常水平。給藥2次后,心肌AngⅡ水平明顯增加(P＜0.05),停藥后的第1周最高,之后逐步下降,停藥后第6周不再出現(xiàn)明顯降低,但是未降低至給藥前的水平。給藥1次心肌凋亡指數(shù)明顯增加(P＜0.05),停藥后的第1周達(dá)到高峰,之后逐步下降,停藥后第5周末不再出現(xiàn)明顯降低,但是數(shù)值仍然高于給藥前。結(jié)論 多柔比星毒性可導(dǎo)致兔心肌AngⅡ水平升高,繼而可通過(guò)活性氧和鈣離子失衡誘導(dǎo)心肌結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞和心室重構(gòu)。

血管緊張素；多柔比星；心臟毒性

蒽環(huán)類藥物是目前比較常用和有效的抗腫瘤藥物，廣泛用于多種腫瘤的治療。但是蒽環(huán)類藥物可能導(dǎo)致心臟毒性反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可以造成充血性心力衰竭，嚴(yán)重影響了蒽環(huán)類藥物臨床應(yīng)用[1]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于蒽環(huán)類藥物的心臟毒性的研究認(rèn)為，蒽環(huán)類藥物及蒽環(huán)藥物-離子復(fù)合物通過(guò)氧化應(yīng)激作用促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成，而且蒽環(huán)類藥物也可以與心肌細(xì)胞內(nèi)Fe3＋結(jié)合，產(chǎn)生螯合物，刺激ROS的生成，同時(shí)心臟組織中抗氧化物質(zhì)減少。ROS一方面通過(guò)膜脂質(zhì)過(guò)氧化破壞細(xì)胞膜和線粒體膜，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)心臟線粒體病以及慢性心肌病的線粒體和呼吸鏈的損傷。另一方面使得細(xì)胞和線粒體內(nèi)外鈣離子的平衡受到破壞，影響重要蛋白的表達(dá)，損傷線粒體DNA，阻止線粒體提供生物能量，降解肌絲，破壞心肌運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2－5]。蒽環(huán)類藥物的心臟毒性反應(yīng)分為急性、亞急性、早期慢性和遲發(fā)性4個(gè)類型[6]。其中早期慢性心臟毒性反應(yīng)出現(xiàn)在給藥后稍晚或數(shù)周到數(shù)月內(nèi)，病變類似于擴(kuò)張型心肌病的表現(xiàn)，隨之出現(xiàn)左心室收縮功能紊亂和充血性心衰，且具有獨(dú)特的病理學(xué)改變，包括肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞漿空泡形成、線粒體腫脹和肌絲排列紊亂和消失。

本研究通過(guò)給兔靜脈注射多柔比星，造成心臟毒性反應(yīng)，超聲檢測(cè)給藥前后心功能，Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

鹽酸多柔比星粉劑(每瓶10 mg，汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):080602)，以生理鹽水稀釋成1 g·L－1。戊巴比妥鈉粉劑(廣州市威佳科技有限公司提供，批號(hào)57-33-0)。SSD-α10數(shù)字超聲診斷儀，日本Hitachi-Aloka公司；5130高頻探頭，探頭頻率5～13 MHz。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

100只雄性健康新西蘭大白兔用于預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)〔廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):0046418，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證號(hào):SYXK (粵)2007-0081〕，約4月齡，體質(zhì)量2～2.5 kg。所有實(shí)驗(yàn)兔置于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)單籠飼養(yǎng)，按需給予飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因死亡而補(bǔ)充兔19只，死亡原因包括厭食、腹瀉、心衰、嚴(yán)重心律失常、麻醉意外及術(shù)中心包填塞。

實(shí)驗(yàn)兔用兔固定器固定，耳緣靜脈注射多柔比星溶液，參照文獻(xiàn)[7]每次注射2 mg·kg－1，每周1次，共8周，總量約相當(dāng)于16 mg·kg－1。給藥8周后停藥，繼續(xù)觀察8周，總實(shí)驗(yàn)時(shí)間16周，分別于給藥前、給藥期間每間隔7 d及停藥后的連續(xù)8周內(nèi)，依次各隨機(jī)取4只兔，共17個(gè)時(shí)間點(diǎn)，按指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3超聲測(cè)定射血分?jǐn)?shù)

每周末隨機(jī)選擇4只兔作為檢查對(duì)象，超聲檢測(cè)前從兔耳緣靜脈緩慢注射3%戊巴比妥鈉1 mL·kg－1麻醉，連接超聲儀心電生理線于兔四肢，通過(guò)雙平面Simpson法測(cè)定射血分?jǐn)?shù)。

1.4心導(dǎo)管測(cè)定左心室壓力最大上升速率

完成射血分?jǐn)?shù)檢查的兔，頸部備皮后使用硬膜外麻醉管連接多導(dǎo)電生理檢查儀，管內(nèi)充滿0.4%肝素氯化鈉溶液，分離兔右側(cè)頸總動(dòng)脈，通過(guò)右頸動(dòng)脈插管，測(cè)定頸總動(dòng)脈內(nèi)血壓，然后繼續(xù)進(jìn)管，通過(guò)主動(dòng)脈瓣口進(jìn)入左心室，測(cè)定左心室壓力最大上升速率 (maximalrate ofrise ofleftventricular pressure，＋dp/dtmax)。

1.5心肌樣本的制備

完成超聲和心導(dǎo)管檢查的4只兔耳緣靜脈靜推注空氣處死。開(kāi)胸剝離心包，得到離體心臟，放入10%甲醛溶液中固定，48 h后取材。

1.6 HE染色及透射電鏡觀察心肌組織形態(tài)和心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

取1.5制備的心肌樣本，常規(guī)HE染色，光鏡檢查攝片，觀察心肌和頸動(dòng)脈病理改變。心肌樣本2.5%戊二醛中固定，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察心肌細(xì)胞肌原纖維的肌小節(jié)、線粒體、肌漿網(wǎng)和心肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。觀察頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、平滑肌細(xì)胞、彈力纖維形態(tài)和排列情況。

1.7 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

取1.5制備的心肌樣本，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。在光鏡400倍視野下，每張切片隨機(jī)拍攝10個(gè)矩形的陽(yáng)性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞核，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比作為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，AI(%)＝凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌AngⅡ水平

使用武漢博士德公司兔抗AngⅡ多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體作為二抗，選擇GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，將1.5獲得的部分離體心臟標(biāo)本置于－196℃液氮中急凍，保存于－70℃低溫冰箱中用于分析。按照標(biāo)準(zhǔn)Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品制備，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光、顯影和定影、凝膠圖像分析。以目標(biāo)條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內(nèi)標(biāo)蛋白的IA比值表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1多柔比星對(duì)新西蘭大白兔心臟射血分?jǐn)?shù)和左心室壓力最大上升速率的影響

表1結(jié)果顯示，與給藥前相比，給藥7次后(第7周起)，射血分?jǐn)?shù)明顯減低(P＜0.05)；給藥8次后，射血分?jǐn)?shù)值下降至谷底。停藥后射血分?jǐn)?shù)小幅上升并呈波動(dòng)趨勢(shì)，但始終低于給藥前，且與給藥8次時(shí)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與給藥前相比，給藥3次后(第3周起)＋dp/dtmax明顯降低(P＜0.05)，停藥1周(第9周)時(shí)達(dá)到最小，之后的＋dp/dtmax數(shù)值呈緩慢上升趨勢(shì)，停藥6周時(shí)達(dá)較高水平，與停藥1周比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。停藥7周和8周后，＋dp/dtmax數(shù)值與6周比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

2.2多柔比星對(duì)新西蘭大白兔心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

光鏡結(jié)果顯示，給藥前心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖1A)；給藥后第1周心肌細(xì)胞程度不等的退行性變(照片略)；第8周時(shí)心肌細(xì)胞廣泛空泡變性，肌原纖維溶解，灶性心肌壞死，部分心肌細(xì)胞核固縮、變形，組織間質(zhì)嚴(yán)重水腫，間質(zhì)纖維組織增多，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)；停藥后心肌細(xì)胞空泡變性和組織間質(zhì)水腫減輕(照片略)。

電鏡結(jié)果顯示，給藥前心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常(圖1C)；給藥第1次心肌細(xì)胞線粒體腫脹，嵴斷裂或消失(圖1D)，繼續(xù)給藥除了可見(jiàn)線粒體腫脹和嵴斷裂外，還可見(jiàn)肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。肌絲排列紊亂或消失，肌節(jié)長(zhǎng)短不一，出現(xiàn)異常收縮帶，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞和纖維增生(圖1E)；給藥第8周時(shí)上述病變范圍更加廣泛呈彌漫分布(圖1F)，停藥4周時(shí)上述病變范圍仍然較為廣泛(圖1G)；停藥7周后上述病變有所減輕，范圍縮小(圖1H)。

Tab.1 Effect of doxorubicin on eject fraction(EF) and maximal rate of rise of left ventricular pressure (＋dp/dtmax)of rabbits

Fig.1 Effect of doxorubicin on New Zealand white rabbit cardiac structure under light microscope(A，B) and transmission electron microscope(C，D，E，F(xiàn)，G，H).A:before administration；B:doxorubicin 2 mg·kg－1×8；C: before administration；D:doxorubicin 2 mg·kg－1×1；E:doxorubicin 2 mg·kg－1×4；F:doxorubicin 2 mg·kg－1×8；G:4 weeks after administration；H:7 weeks after administration.Arrows show cristae of mitochondria，mitochondrial swelling and cristae，abnormal contraction bands.

Tab.2 Effect of doxorubicin on apoptosis index(Al) in myocardium of rabbits

2.3 多柔比星對(duì)新西蘭大白兔心肌細(xì)胞凋亡的作用

表2結(jié)果顯示，心肌AI在第1次給藥后(第1周)明顯增加，與給藥前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。之后AI呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)。AI在停藥后1周達(dá)到高峰，之后AI呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，停藥后5周達(dá)到較低水平，與停藥后1周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。停藥后6～8周與停藥后5周相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 多柔比星對(duì)新西蘭大白兔心肌組織內(nèi)血管緊張素Ⅱ水平的影響

Western蛋白質(zhì)印跡(圖2A)及其半定量結(jié)果(圖2B)顯示，給藥后心肌組織內(nèi)AngⅡ表達(dá)呈逐步上升趨勢(shì)。從圖2B可見(jiàn)，給藥2次后(第2周)AngⅡ表達(dá)與給藥前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.61±0.46 vs 0.66± 0.23，P＜0.05)；在停藥1周時(shí)，AngⅡ達(dá)到最高，然后呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)；停藥后6周達(dá)較低水平，與停藥后1周相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.91±0.35 vs 4.20± 0.41，P＜0.05)；停藥后7～8周與停藥后6周相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明停藥后的恢復(fù)程度有限。

Fig.2 Effect of doxorubicin on angiotensinⅡ(AngⅡ) level in myocardium of rabbits by Western blotting. See Tab.1 for the treatment.A:Western blot result.B:the semiquantitative result of A.1:before administration；2:doxorubicin 2 mg·kg－1×1；3:doxorubicin 2 mg·kg－1×2；4:doxorubicin 2 mg·kg－1×3；5:doxorubicin 2 mg·kg－1×4；6:doxorubicin 2 mg·kg－1×5；7:doxorubicin 2 mg·kg－1×6；8:doxorubicin 2 mg·kg－1×7；9:doxorubicin 2 mg·kg－1×8；10－17:one to eight weeks after administration，respectively.，n＝4.?P＜0.05，compared with before administration；＃P＜0.05，compared with one week after administration.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在正常兔心肌組織中，存在較低水平的AngⅡ表達(dá)，當(dāng)靜脈給予多柔比星后，早期可以檢測(cè)到心肌AngⅡ水平增加，推斷是AngⅡ的介導(dǎo)氧化應(yīng)激等作用以及心臟代償機(jī)制開(kāi)始發(fā)動(dòng)，心肌組織內(nèi)AngⅡ含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。以往研究認(rèn)為，AngⅡ在心肌組織中的水平升高是心室重構(gòu)的特征之一，升高的原因包括水鈉潴留、增加左心室舒張末期容積導(dǎo)致心肌受到的牽張力增大和醛固酮的增加[8－10]。第8周最后1次給藥后，心肌損害仍然有所進(jìn)展，因此，在第9周兔的心肌內(nèi)AngⅡ水平明顯上升達(dá)到高峰。以往研究認(rèn)為，AngⅡ可以激活NADPH氧化酶復(fù)合體，由此可以引起ROS的增加，這時(shí)伴隨心肌氧自由基清除能力下降。因此AngⅡ可以通過(guò)ROS途徑誘導(dǎo)和促進(jìn)心室重塑，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子平衡破壞可以導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害[11－16]。隨著停藥時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，心臟功能部分好轉(zhuǎn)，心肌組織內(nèi)的AngⅡ的水平呈逐步下降趨勢(shì)。停藥后，心肌毒性損害逐漸減弱，ROS含量減少及鈣離子失衡好轉(zhuǎn)，從而心肌結(jié)構(gòu)得到部分修復(fù)，細(xì)胞病變有所減輕，凋亡的心肌細(xì)胞所占的比例逐步減少，隨著心肌組織修復(fù)、纖維組織增生，左心室收縮功能逐步得到一定程度的恢復(fù)。以往研究也發(fā)現(xiàn)，在心肌受損后部分固有心肌細(xì)胞能夠重返細(xì)胞分裂周期，通過(guò)低強(qiáng)度分化復(fù)制從而發(fā)揮修復(fù)代償作用[17]。有研究表明，AngⅡ受體抑制劑可以改善心力衰竭，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心室重塑[18－19]。

綜上所述，多柔比星可導(dǎo)致兔心肌AngⅡ水平升高，升高的AngⅡ可能通過(guò)ROS和鈣離子失衡誘導(dǎo)心肌結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步破壞和心室重構(gòu)。

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(本文編輯:喬 虹)

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Effects of doxorubicin on changes of cardiac function and angiotensinⅡlevel in myocardium of New Zealand white rabbits

ZHANG Hui1，ZHENG Rong-qin1，QIAN Xiao-xian2，HAO Bao-shun2，ZHANG Cheng-xi2
(1.Department of Ultrasound，the 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Institute of Diagnostic and Interventional Ultrasound，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China；2.Cardiovascular Department，the 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China)

OBJECTlVE To investigate the myocardial toxicity of doxorubicin on the myocardium of rabbits and mechanism.METHODS Doxorubicin 2 mg·kg－1was injected once a week for eight weeks. After discontinuation of doxorubicin，observation was performed for another 8 weeks.Every weekend，ultrasound examination，cardiac catheterization，angiotensinⅡ(AngⅡ)Western blotting and pathological examination were performed to analyze eject fraction(EF)，maximal rate of rise of left ventricular pressure(＋dp/dtmax)，AngⅡexpression level，apoptosis index(AI)and the structure of the myocardium. RESULTS At the 7th injection，EF decreased(P＜0.05)，but reached the bottom value at the 8th injection.At the 3rd injection，left ventricular＋dp/dtmaxdecreased(P＜0.05)and reached the bottom value one week after withdrawal.After that，it increased and reached a high value six weeks after withdrowal.But it was still lower than before administration.At the 2nd injection，AngⅡexpression increased (P＜0.05).At 1 week after withdrawal，it reached the top value，but than decreased and reached a low value six weeks after withdrowal，but was still higher than before administration.At the 1st injection，AI increased(P＜0.05).At 1 week after withdrawal，it reached the top value，but then decreased and reached a low value 5 weeks after withdrawal.But it was still higher than before administration. CONCLUSlON Doxorubicin cardiac toxicity can induce an elevated level of myocardial AngⅡ，possibly associated with increased aldosterone and myocardial tension.Increased AngⅡ may induce further myocardial structural damage and ventricular remodeling through the ROS and calcium imbalance.

angiotensin；doxorubicin；cardiac toxicity

ZHENG Rong-qin，E-mail:zhengrongqin123＠163.com

R979.1

A

1000-3002(2014)04-0497-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.004

Foundation item: The projectsupported by Guangdong ProvincialScience ＆ Technology Foundation (2011B061300005)

2013-05-10 接受日期:2013-12-25)

廣東省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2011B061300005)

張 輝(1974－)男，博士，主要從事心血管疾病研究；鄭榮琴(1964－)，女，教授，主要從事超聲診斷與介入治療研究。

鄭榮琴，E-mail:zhengrongqin123＠163.com