程瑞鳳，景 晶，華 冰，薛旻秋，陸釗罡，趙偉鴻，樊紫周，果 嘉，楊衛(wèi)東，王英華，彭曉東，3

(1.寧夏醫(yī)科大學藥學院藥理學系，寧夏銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗所，寧夏銀川 750004；3.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏銀川 750004)

甘草總黃酮提取部位抗小鼠抑郁活性可能與其增強中樞5-羥色胺能神經功能有關

程瑞鳳1，景 晶1，華 冰1，薛旻秋1，陸釗罡1，趙偉鴻1，樊紫周1，果 嘉1，楊衛(wèi)東1，王英華2，彭曉東1，3

(1.寧夏醫(yī)科大學藥學院藥理學系，寧夏銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗所，寧夏銀川 750004；3.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏銀川 750004)

目的 探討甘草總黃酮提取部位(LF)的抗抑郁作用及可能的作用機制。方法 KM小鼠分別每天po給予LF 5,30和180 mg·kg－1,連續(xù)21 d,于第1天、第7天和第21天給藥后1 h進行強迫游泳實驗(FST),記錄4 min內不動時間；另取KM小鼠,按照FST的實驗分組處理,于第1天、第7天和第21天po藥后1 h進行懸尾實驗(TST),記錄4 min內不動時間。ICR小鼠分別每天po給予LF 50,150和400 mg·kg－1,連續(xù)7 d,進行利血平誘發(fā)癥狀拮抗實驗(ART),于末次給藥后1 h采用記錄小鼠運動不能、上瞼下垂和監(jiān)測肛溫；另取KM小鼠,分別每天po給予LF 50,150和400 mg·kg－1,連續(xù)7 d,于末次給藥1 h后sc閾致死劑量的育亨賓,觀察24 h小鼠存活情況；取 KM小鼠,分別每天 po給予 LF 50,150和400 mg·kg－1,連續(xù)7 d,第8天進行5-羥色氨酸誘導的甩頭實驗(HTT),記錄30 min內的甩頭次數,并檢測皮質、海馬和丘腦中單胺氧化酶(MAO)活性。結果 FST和TST實驗結果顯示,與正常對照組比較,LF能夠減少小鼠游泳和懸尾的不動時間(P＜0.05),且與氟西汀有相似的時-效特點。ART實驗結果顯示,LF能夠拮抗給予利血平1 h后引起的小鼠上瞼下垂和運動不能(P＜0.05),但不能夠拮抗4 h后引起的小鼠體溫降低。LF對育亨賓閾致死劑量引起的小鼠死亡沒有協同增加作用；LF 150和400 mg·kg－1均能明顯協同增加注射5-羥色氨酸后甩頭次數(P＜0.05),小鼠皮質、海馬和丘腦中MAO活性與正常對照無差異。結論 LF在急性絕望小鼠模型上具有抗抑郁樣作用,其作用機制可能與其直接增強腦內5-羥色胺能神經功能有關。

抑郁癥；甘草；黃酮；5-羥色氨酸；單胺氧化酶；5-羥色胺能神經元

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多種植物的根和根莖。甘草提取物具有良好的抗實驗動物抑郁模型的活性[1－4]，其涉及的活性成分包括甘草素(liquiritigenin)、異甘草素(isoliquiritigenin)、光甘草定 (glabridin)、甘草苷(liquiritin)和異甘草苷(isoliquiritin)等，而所涉及的可能作用機制包括對中樞單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)的抑制[3，5]；抑 制 5-羥 色 胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取轉運體蛋白5-HT轉運蛋白(serotonintransporter，SERT)及靶位突觸后膜5-HT1A受體的阻斷作用[4]。由于活性成分多為黃酮，所以增強中樞的抗氧化能力亦可能為甘草抗抑郁活性的重要機制[1，6]。而筆者前期實驗研究表明，從寧夏地區(qū)栽培甘草中獲得的甘草總黃酮(licorice flavonoids，LF)提取部位具有抗大鼠慢性應激抑郁行為的作用，且可能機制涉及對海馬神經再生能力的保護作用[7]。

本研究擬采用小鼠強迫游泳實驗(forced swimming test，FST)和懸尾實驗(tail suspension test，TST)，評價LF在急性絕望模型上的抗抑郁樣作用；采用 5-羥色氨酸(5-hydroxy-L-tryptophan，5-HTP)誘導小鼠甩頭實驗(head-twitches test，HTT)、育亨賓毒性增強實驗(yohimbine toxicity potentiation test，YTPT)、利血平誘發(fā)癥狀拮抗實驗(antagonism of reserpine-induced symptoms test，ART)和腦內MAO活性檢測實驗，以期進一步研究分析LF的抗抑郁作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑

LF，寧夏藥檢所王英華主任藥師提供，其中主要含有甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮B、刺甘草查爾酮和4′，7-二羥基黃酮等[8－11]。鹽酸氟西汀分散片購自中國蘇州制藥有限公司；帕吉林 (批 號:068K1468)，5-HTP(批 號: C11H12N20C)，育亨賓(批號:MFCD00012674)，利血平(批號:068K1585)和丙米嗪(批號: SLBC6401V)均為美國Sigma產品；重酒石酸去甲腎上腺素注射液購于上海禾豐制藥有限公司；蛋白定量測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物

昆明(KM)小鼠和 ICR小鼠，雄性，體質量16～18 g，清潔級動物，由寧夏醫(yī)科大學動物中心提供，合格證號:SCXY(寧)2005-0001。動物于實驗前適應性飼養(yǎng)3 d，自然晝夜節(jié)律光照條件下飼養(yǎng)，自由獲得食物和水，并維持室溫20～24℃，相對濕度50%～60%，每籠5只群養(yǎng)。行為學實驗于上午9:00～11:00進行。

1.3 FST檢測不動時間

80只雄性KM小鼠，實驗室適應飼養(yǎng)3 d后，通過FST進行實驗用鼠的篩選。將單只小鼠放入水深15 cm，直徑20 cm，水溫保持在21～25℃的小桶中，期間小鼠后肢不能觸及桶底，強迫游泳4 min。按照標準:① 前80～90s內不動小鼠；②后90 s內絕大多數時間一直游泳，偶爾不動小鼠；③后150 s內游泳不動時間＞80%小鼠。剔除不動時間較長和較短的小鼠。將所得合格小鼠60只，按體質量隨機分為正常對照組(去離子水，20 mL·kg－1，po)，LF組(5，30和180 mg·kg－1，po)和氟西汀(20 mg·kg－1，po)5組，每組12只；每天上午8:00給藥，連續(xù)21 d，并于給藥前1 h禁食不禁水。給藥期間分別于給藥后的第1天、第7天和第21天po給藥1 h后進行FST。實驗具體參照文獻方法[12－14]。將小鼠分別放入同前所述相同條件的小桶內，觀察記錄6 min，并累計后4 min內小鼠在水中停止掙扎或者呈漂浮狀態(tài)、僅微小肢體運動以保持頭部浮在水面的持續(xù)時間(即不動時間)。

1.4 TST檢測不動時間

取80只雄性KM小鼠，實驗室適應飼養(yǎng)3 d后，通過FST進行實驗用鼠的篩選。將小鼠尾部穿過孔板，距尾尖3 cm處軟夾、膠布固定并懸于自制內部漆黑的懸尾箱(32 cm×32 cm×30 cm，且僅正前方呈10 cm×10 cm的圓形開口，便于觀察攝錄)內，小鼠頭部距底面3 cm。篩選時間為3 min，剔除不動時間＜25 s及不動時間＞150 s的小鼠。將滿足要求的60只小鼠按照1.3項進行分組及給藥，并于第1天、第7天和第21天給藥1 h后依照文獻方法[15]791，[16]記錄共 6 min，記錄后4 min的不動時間。

1.5利血平拮抗實驗

取雄性ICR小鼠72只，實驗室適應飼養(yǎng)3 d后，隨機分為正常對照組、丙米嗪20 mg·kg－1(po)及LF 50，150和400 mg·kg－1(po)，每組12只。根據體質量按20 mL·kg－1灌胃給藥，連續(xù)7 d。各組在第7天給藥后1 h均ip給予利血平4 mg·kg－1，按文獻方法[13]，[15]807觀察測定以下指標。

1.5.1運動不能觀察

ip利血平1 h后，將小鼠放入直徑為7.5 cm的圓圈內觀察15 s，記錄未出圈的小鼠數目。

1.5.2眼瞼下垂觀察

ip利血平1 h后，將小鼠單個豎放15 s，觀察小鼠上瞼下垂程度。眼瞼閉合程度評分標準:全閉為4分，3/4閉為3分，1/2閉為2分，1/4閉為1分，未閉為0分。分別將各組小鼠的評分歸納統(tǒng)計，取均值比較。

1.5.3肛溫測定

末次po給藥前將電子體溫計探頭插入小鼠肛門內，維持10 s檢測肛溫作為小鼠基礎體溫；ip利血平4 h后重復測量肛溫。計算用藥前后肛溫變化的差值。

1.6育亨賓小鼠毒性增強實驗觀察死亡數

預實驗獲得育亨賓的小鼠閾致死劑量為30 mg·kg－1(sc)。60只雄性KM小鼠，實驗室適應飼養(yǎng)3 d，按照體質量隨機分正常對照組及LF 50，150和400 mg·kg－1(po)，每組15只。根據體質量按每只小鼠20 mL·kg－1給予量連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃30 min后給予相應閾致死劑量的育亨賓(30 mg·kg－1，sc)，觀察記錄24 h內每組小鼠的死亡數[13，17]。

1.7 5-HTP誘導小鼠甩頭實驗和MAO活性檢測

參照文獻方法[15]808。預實驗發(fā)現，給予正常小鼠帕吉林(100 mg·kg－1，ip)30 min后，再次給予相應劑量的5-HTP可以記錄到特征性甩頭行為的閾劑量為10 mg·kg－1(ip)。

取雄性KM小鼠90只，實驗室適應飼養(yǎng)3 d后，隨機分為正常對照組、氟西汀20 mg·kg－1組、LF50，150及400 mg·kg－1組，每組15只。連續(xù)ig給藥7 d后，第8天各組首先ip給予帕吉林100 mg·kg－1，30 min后再行 ip給予 5-HTP 10 mg·kg－1，并隨即將小鼠置于觀察箱內記錄小鼠每5 min的甩頭次數，共測6次，持續(xù)觀察30 min。

實驗結束后，將小鼠快速處死，在冰臺上迅速操作取出全腦，分別剝離皮質、海馬和丘腦，然后分別按1∶10質量體積比加生理鹽水，制成10%勻漿，2000×g離心10 min得上清液。采用考馬斯亮藍法檢測上清液中蛋白質含量，并調整所有樣品蛋白質濃度為1 g·L－1。測定酶活性時取樣品液0.5 mL，加入0.3 mL 5-HT 4 mmol·L－1，用磷酸緩沖液0.2 mol·L－1(pH 7.4)補足至3 mL。反應系統(tǒng)在37℃下保溫1 h，每隔15 min振蕩混合1次，1 h后加入0.6 mL鹽酸1 mol·L－1終止反應，之后再加入乙酸丁酯4 mL，混合提取，2000×g離心10 min，取上清液在280 nm處測定吸光度值(absorbance，A)。酶活性以每1 mg組織蛋白在37℃ 1 h內產生0.01個A值為一個活性單位(U)，以kU·g－1蛋白為單位。

1.8 統(tǒng)計學分析

結果采用Graph PadInStat(Instant Biostatistics Version3.06)軟件實施分析。量反應資料數據以表示，選用單因素方差分析和Dunnett t檢驗。質反應資料采用χ2檢驗。以P＜0.05判斷有顯著性差異。

2 結果

2.1 LF對小鼠不動時間的影響

2.1.1 強迫游泳實驗

如表1所示，在第1天ig給藥1 h后，測得的不動時間各組無差別。第7天給藥后，與正常對照組比較，氟西汀20 mg·kg－1組則減少33%(P＜0.01)；LF 30和180 mg·kg－1組小鼠不動時間分別減少25%(P＜0.05)和32%(P＜0.01)。第21天給藥后，氟西汀20 mg·kg－1組則減少27%(P＜0.01)；LF 5，30和180 mg·kg－1組小鼠不動時間分別減少17%(P＜0.05)，25%(P＜0.05)和26%(P＜0.01)。說明LF在小鼠FST模型上具有抗抑郁作用，且與氟西汀作用強度相似。

Tab.1 Effect of licorice flavonoids(LF)on immobility time in forced swimming test(FST)in mice

2.1.2 懸尾實驗

如表2所示，在第1天實施灌胃給藥1 h后，測得的不動時間各組沒有差別。在第7天給藥后，與正常對照組比較，給予氟西汀20 mg·kg－1組小鼠不動時間減少 26%(P＜0.01)；LF 30和180 mg·kg－1組小鼠不動時間分別減少19%(P＜0.05)和31%(P＜0.01)。21 d后，氟西汀組則減少27%(P＜0.05)；LF 5，30和180 mg·kg－1劑量組小鼠不動時間分別減少 30%(P＜0.01)，32% (P＜0.01)和 34%(P＜0.01)。說明 LF在小鼠TST模型上具有抗抑郁作用，作用強度與氟西汀相似。

Tab.2 Effect of LF on immobility time in tail suspension test in mice

2.2 LF對利血平誘導的小鼠體溫下降、上瞼下垂及運動不能的影響

如表3所示，給藥7 d后，只有丙米嗪20 mg·kg－1組能夠拮抗注射利血平4 h后引起的體溫降低，拮抗率為53%(P＜0.01)；丙米嗪及LF 50，150和400 mg·kg－1均能夠明顯拮抗注射利血平1 h后引起的上瞼下垂，拮抗率分別為82%(P＜0.01)，61%(P＜0.01)，73%(P＜0.01)和85%(P＜0.01)；同樣，丙米嗪及各劑量組的LF均能夠明顯拮抗注射利血平1h后引起的運動不能。說明LF拮抗利血平誘導的上眼瞼下垂，可能與其增強中樞5-HT神經功能有關；拮抗利血平誘導的運動不能，可能與LF直接或間接增強中樞多巴胺能神經功能有關。

2.3 LF對小鼠育亨賓毒性增強實驗中死亡率的影響

給藥7 d后，給予LF 50，150和400 mg·kg－1小鼠分別給予閾致死劑量的育亨賓后，小鼠死亡率分別為2/15，1/15和2/15，與單純育亨賓組無統(tǒng)計學差異。說明LF的抗抑郁作用可能與促進中樞去甲腎上腺素神經功能無關。

2.4 LF對5-HTP誘導小鼠甩頭和MAO活性的影響

如表4所示，給藥7 d后，氟西汀20 mg·kg－1及LF 150和400 mg·kg－1均能夠明顯增加注射5-HTP后小鼠的甩頭次數。說明LF可能具有增強中樞5-HT能神經功能的作用。表5結果顯示，LF對各皮質、海馬及丘腦中MAO活性無影響。

Tab.3 Effect of LF on body temperature，eye ptosis and akinesia of mice

Tab.4 Effect of LF on head-twitches of mice

Tab.5 Effect of LF on monoamine oxidase(MAO)activity in brain of mice

3 討論

本研究結果發(fā)現，LF在亞急性用藥(7 d)即對FST和TST中的不動時間產生影響，且隨用藥時間的延長效果則更為明顯，說明LF不僅具有對抗慢性應激抑郁行為的作用[7]，在急性絕望模型上同樣具有抗抑郁樣作用。

現代藥理學研究表明，目前臨床使用的抗抑郁藥最終的療效多數與增強中樞5-HT能神經功能有關[18－19]。利血平作為傳統(tǒng)的單胺類神經遞質的耗竭劑，主要通過抑制囊泡的再攝取功能使單胺神經遞質滯留在囊泡外而被MAO降解，從而使遞質耗竭、神經功能下降，繼而引起行為和生理反應而。作為經典的抗抑郁動物實驗模型。通過對利血平拮抗實驗所表現出的動物行為分析與中樞特定神經功能變化的相關性分析得出[13－14]，能夠拮抗利血平引起的上眼瞼下垂癥狀的藥物，可能與其增強中樞腎上腺素能神經功能或5-HT能神經功能機制有關；能夠拮抗利血平引起的體溫下降的藥物，可能與其直接或間接激動中樞β-腎上腺素受體有關；而藥物能夠拮抗利血平引起的運動不能癥狀，可能與其直接或間接增強中樞多巴胺能神經功能機制有關。本研究發(fā)現，給予LF 7 d，各劑量組對利血平誘發(fā)的眼臉下垂及運動不能癥狀有較好的改善作用，而對體溫下降癥狀沒有作用。所以，推測LF可能有中樞5-HT能神經功能或多巴胺能神經功能增強作用，而無中樞β-腎上腺素受體的激動效應。

本研究進一步發(fā)現，同樣給予7 d的LF不能夠協同增強閾劑量水平的育亨賓產生的毒性反應。而研究表明，育亨賓可選擇性地抑制中樞去甲腎上腺素能神經突觸前膜上的α2受體，抑制去甲腎上腺素的再攝取，進而增強中樞去甲腎上腺素能神經的功能。當將可能增強中樞去甲腎上腺素神經功能的藥物與閾致死劑量的育亨賓同時應用，就可以通過上述機制產生協同作用，增強毒性反應。該模型主要用于研究可能通過促進中樞去甲腎上腺素能神經功能發(fā)揮治療作用的藥物作用機制的分析[13，18]。所以，推測LF的抗抑郁作用可能與增強中樞去甲腎上腺素能神經功能無關。

5-HTP誘導小鼠甩頭實驗模型最早由Corne等[20]在1963年建立標準。如果預先給予可能增強中樞5-HT能或去甲腎上腺素能神經功能藥物，如5-HT再攝取抑制劑類抗抑郁藥或MAO抑制劑，可使中樞相應遞質水平蓄積增多；若再給予MAO抑制劑帕吉林進一步抑制MAO的活性后，再行給予5-HTP進一步增加中樞內5-HT水平，實驗動物出現特殊的甩頭樣行為癥狀[15]808，[20]。本研究結果顯示，給予7 d的LF能夠明顯協同增加5-HTP引起的甩頭次數，并且體現了良好的劑量依賴關系。同時本研究通過檢測小鼠腦內不同腦區(qū)MAO活性發(fā)現，與他人的研究結果有所不同[3，5]，LF對MAO沒有明顯的抑制作用，原因可能與他人采用離體實驗方法有關。

綜上所述，從寧夏地區(qū)栽培甘草中提取分離獲得的LF在急性絕望模型上具有抗抑郁樣作用，其機制可能涉及直接增強中樞5-HT神經功能。

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Anti-depression effect of licorice flavonoids from Glycyrrhiza uralensis through promotion of central serotonergic neural function in mice

CHENG Rui-feng1，JING Jing1，HUA Bing1，XUE Min-qiu1，LU Zhao-gang1，ZHAO Wei-hong1，FAN Zi-zhou1，GUO Jia1，YANG Wei-dong1，WANG Ying-hua2，PENG Xiao-dong1，3
(1.Department of Pharmacology，College of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.Ningxia Institute for Drug Control，Yinchuan 750004，China；3.Ningxia Key Laboratory of Cerebrocranial Diseases，Yinchuan 750004，China)

OBJECTlVE To investigate the antidepressant effect and related mechanism of the total flavonoids extract parts(licorice flavonoids，LF)from Glycyrrhiza uralensis Fisch.cultivated locally in Ningxia.METHODS Forced swimming test(FST)and tail suspension test(TST)were adopted to study the antidepressant pharmacological effect in the acute stress-induced depression model in mice. The KM mice were intragastrically administered with LF(5，30 and 180 mg·kg－1)once daily，for 21 consecutive days.One hour after the first，seventh and last administrations，the mice were submitted to FST by recording the immobility period within the last 4 min of the total 6 min in both tests and the results were expressed as decrease in immobility period with respect to vehicle control.In TST，the other group of KM mice was used to evaluate the antidepressant effect in same protocol.In the antagonism of reserpineinduced symptoms test(ART)，ICR mice were administered intragastrically with LF(50，150 and 400 mg·kg－1)once daily for 7 consecutive days.One hour after the last administration，the mice received reserpine(4 mg·kg－1，ip)，and ptosis or akinesia was measured 1 h after reserpine injection while rectal temperature was measured 4 h after the reserpine injection respectively.The same protocol was adopted in yohimbine toxicity potentiation test(YTT)as in ART.Thirty minutes fter the last adminis-tration，the mice received the threshold lethal dosage of yohimbine(30 mg·kg－1，sc)respectively，and the death number of the mice was calculated in 24 h after the yohimbine administration.In the 5-hydroxy-L-tryptophan(5-HTP)induced head-twitches test(HTT)in mice，after being administered intragastrically with LF(50，150 and 400 mg·kg－1)once daily for 7 consecutive days，the mice received pargiline (100 mg·kg－1，ip)the next day，and 30 min later，5-HTP(10 mg·kg－1，ip)was intraperitoneally injected to induced the head twitch respectively，and the times of head twitch in a 30 min period after 5-HTP treatment were observed at 6 time points.After HTT，the mice were sacrificed quickly，and the monoamine oxidase(MAO)activity in the brain cortex，hippocampus and thalamus was examined to evaluate the antidepressant effect of flavonoids with MAO inhibition.RESULTS Compared with the vehicle control，LF significantly decreased the immobility period in both FST and TST(P＜0.05).LF(50，150 and 400 mg·kg－1)antagonized the ptosis and akinesia symptoms respectively in 1 h after reserpine administration(P＜0.05)，but failed to antagonize hypothermia produced 4 h after reserpine administration.Also，at the same dosage，LF did not synergetically produce the enhancement of death by subcutaneous injection of yohimbine at the threshold lethal dosage.LF(150 and 400 mg·kg－1)could significantly and synergetically increase 5-HTP induced head-twitches response(P＜0.05)，but LF could not promote MAO activity in the cortex，hippocampus and thalamus at the same dosage.CONCLUSlON LF exerts antidepressant-like effect on the model of acute despair test.The mechanism might be related to direct enhancement of the serotonergic neural function in the brain.

depression； Glycyrrhiza uralensis Fisch.； flavonoids； 5-hydroxy-L-tryptophan；monoamine oxidase；serotonergic neurons

PENG Xiao-dong，E-mail:pengxd＠nxmu.edu.cn，Tel:(0951)6980192

R285.5，R964

A

1000-3002(2014)04-0484-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.002

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81060113)

2013-12-09 接受日期:2014-05-20)

(本文編輯:喬 虹)

國家自然科學基金(81060113)

程瑞鳳(1987－)，女，碩士研究生，主要從事神經精神藥理學研究，E-mail:crf＿1987618＠126.com；彭曉東(1967－)，男，教授，主要從事神經精神藥理學研究，E-mail:pengxd＠nxmu.edu.cn.

彭曉東，E-mail:pengxd＠nxmu.edu.cn，Tel:(0951)6980192