李夏春，王志強(qiáng)，柳秀平

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，湖北宜昌 443002；2.杭州市中醫(yī)院，浙江杭州 310006)

抑制JNK磷酸化參與褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素引起的tau蛋白過度磷酸化的保護(hù)機(jī)制

李夏春1，王志強(qiáng)1，柳秀平2

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，湖北宜昌 443002；2.杭州市中醫(yī)院，浙江杭州 310006)

目的 探討花萼海綿誘癌素(CA)在成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)引起tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制,及褪黑素對(duì)其是否具有保護(hù)作用。方法 小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)給予CA 5 nmol·L－1處理,或同時(shí)給予褪黑素50 mol·L－1,或同時(shí)給予維生素E(Vit E)50 mol·L－1處理12 h,用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)tau蛋白在Ser422位點(diǎn)的磷酸化水平,磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)和磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶(p-MKK4)的含量,免疫熒光檢測(cè)p-JNK含量和分布,熒光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量,32P-特異底物標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性。結(jié)果 CA在N2a細(xì)胞引起tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平顯著升高(1.70±0.19,1.0,P＜0.01),褪黑素拮抗CA引起的tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化(0.98± 0.12,1.70±0.19,P＜0.01)；CA引起細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高(μmol·g－1蛋白,0.241±0.006,0.141±0.006, P＜0.01),褪黑素和Vit E均可抑制CA引起的細(xì)胞內(nèi) MDA含量升高(μmol·g－1蛋白,0.172±0.004, 0.193±0.005,0.241±0.006,P＜0.01)；CA不改變p38MAPK活性和蛋白水平,但引起p-JNK含量升高(1.91±0.27,1,P＜0.01)和p-MKK4(1.81±0.09,P＜0.01)含量升高,褪黑素抑制CA引起的p-JNK含量升高(1.11±0.15,1.91±0.27,P＜0.01)和p-MKK4(1.14±0.06,1.81±0.09,P＜0.01)含量升高；JNK抑制劑SP600125可抑制CA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化,MKK4磷酸化抑制劑地昔帕明可消除CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化和tau蛋白過度磷酸化。結(jié)論 褪黑素抑制JNK磷酸化參與其對(duì)CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化的預(yù)防作用。

褪黑素；花萼海綿誘癌素；tau磷酸化；絲裂原活化蛋白激酶激酶4

腦神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié) (neurofibrillary tangles，NFT)是阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要病理特征之一。研究表明，NFT與患者的癡呆程度呈顯著正相關(guān)[1]。因此，揭示NFTs形成的機(jī)制并尋找阻斷藥物是目前AD研究的重點(diǎn)。NFT主要由過度磷酸化的tau蛋白構(gòu)成。用AT-8，PHF-1和pS422抗體進(jìn)行流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)AD患者腦皮質(zhì)突觸富含磷酸化的tau[2]。用結(jié)合Ser422位點(diǎn)磷酸化的tau的肽段進(jìn)行免疫，AT100和ps422抗體顯示其降低不溶性tau的量，并可使tau轉(zhuǎn)基因小鼠在Y迷宮的新臂中的活動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)[3]。說明tau的Ser422位點(diǎn)磷酸化是AD患者認(rèn)知障礙的關(guān)鍵因素。AD患者常有睡眠-覺醒節(jié)律紊亂和褪黑素水平嚴(yán)重降低[4]。且AD患者應(yīng)用褪黑素治療后夜間行為激進(jìn)和認(rèn)知障礙明顯改善[5]。近期有報(bào)道腹腔注射褪黑素9 d可預(yù)防花萼海綿誘癌素(calyculin A，CA)誘導(dǎo)的突觸素丟失和記憶維持障礙及 tau蛋白過度磷酸化[6]。AD患者常有蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A，PP-2A)活性下降，并且隨著PP-2A活性下降，tau蛋白在tau-1，AT-8，CP13，pS262，pS422位點(diǎn)的過度磷酸化增加[7]。這說明PP-2A活性下降參與tau蛋白pS422位點(diǎn)過度磷酸化和AD患者的認(rèn)知障礙。作者曾報(bào)道褪黑素減輕CA所致tau蛋白Ser199，Thr205，Ser396過度磷酸化的機(jī)制與褪黑素升高PP-2A活性和對(duì)抗CA所致氧化應(yīng)激有關(guān)[8]。因?yàn)檠趸瘧?yīng)激可激活應(yīng)激相關(guān)激酶，為探討褪黑素改善記憶的可能機(jī)制，本研究應(yīng)用CA處理N2a細(xì)胞，或同時(shí)給予褪黑素，或同時(shí)給予維生素E(vitamin E，Vit E)處理，探討CA引起tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制，及褪黑素對(duì)其是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

培養(yǎng)細(xì)胞所用胎牛血清(FBS)、DMEM、Opti-MEM購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、丙烯酰胺(Arc)、N，N-亞甲叉-雙丙烯酰胺(Bis)小牛血清白蛋白(BSA)、褪黑素、Vit E、地昔帕明、SP600125均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和過硫酸銨(AP)購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自美國(guó)Hybond公司；多克隆抗體R145d(1∶1000)為王建枝教授饋贈(zèng)；多克隆抗體111e(識(shí)別總tau，1∶500)購(gòu)自美國(guó)Sternberger公司，多克隆抗體 p38MAPK(C-20)(sc-535)，p-JNK(G-7)(sc-6254)，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，多克隆抗體 MKK4(1∶1000)、JNK(9252) (1∶1000)，p-MKK4(Ser257/Thr261)(1∶1000)，β肌動(dòng)蛋白抗體(1∶1000)為美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗和ECL顯色液為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；CA購(gòu)自美國(guó)Biochemical公司；[32P]ATP北京亞輝生物醫(yī)藥公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞株(N2a)由華中科技大學(xué)王建枝教授贈(zèng)予。細(xì)胞用DMEM/Opti-MEM(1∶1)培養(yǎng)基(FBS 50 g·L－1)，在5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%豐度時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h誘導(dǎo)細(xì)胞分化，再進(jìn)行給藥處理。

1.3 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) tau蛋白和MKK4/JNK磷酸化水平

①細(xì)胞分別用等體積DMSO，CA 2.5，5.0，10 nmol·L－1處理12 h；或分別用等體積DMSO，CA 5.0 nmol·L－1，CA 5.0 nmol·L－1＋褪黑素25，50和100 μmol·L－1共處理12 h；或用等體積DMSO，CA 5.0 nmol·L－1，CA 5.0 nmol·L－1＋褪黑素50 μmol·L－1，CA 5.0 nmol·L－1＋VitE 50 μmol·L－1處理12 h。

② 細(xì)胞分別用等體積 DMSO，SP600125 40 μmol·L－1，CA 5 nmol·L－1＋SP600125 5，10，20和40 μmol·L－1(SP600125預(yù)處理2 h后給予CA處理12 h)；或等體積DMSO，地昔帕明20 μmol·L－1處理2 h，CA 5 nmol·L－1處理12 h，CA 5 nmol·L－1＋地昔帕明5，10，20 μmol·L－1(地昔帕明預(yù)處理2 h后給予CA處理12 h)。

以上處理完畢，立即提取細(xì)胞蛋白，測(cè)定細(xì)胞濃度，進(jìn)行免疫印跡分析[9]。免疫印跡結(jié)果掃描后用Image J圖像分析軟件分析。以目標(biāo)蛋白的積分吸光度值與內(nèi)標(biāo)蛋白積分吸光度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞內(nèi)丙二醛(maIondiaIdehyde，MDA)含量測(cè)定

N2a細(xì)胞按正常組(等體積 DMSO)，CA 5.0 nmol·L－1組，褪黑素(褪黑素50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1組， Vit E 50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1的分組加藥處理12 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，細(xì)胞刮收集細(xì)胞。采用熒光法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)MDA水平測(cè)定[10]。

1.5 p38MAPK水平及活性的檢測(cè)

1.5.1 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p38MAPK表達(dá)水平

細(xì)胞種植于 6孔板，按正常組(等體積DMSO)，CA 5.0 nmol·L－1，褪黑素50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1，VitE 50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1給藥處理12 h后，每孔加入 80 μL溫和裂解液(mmol·L－1:Tris-HCl 10，pH 7.4，NaCl 150，EGTA 2，DTT 2，Na3VO43，NaF 20，苯甲基磺酰氟1和胰蛋白酶抑制劑 2 μg·L－1)，4℃勻漿10 min，收集細(xì)胞裂解液，18 000×g，4℃離心15 min，取上清，BCA法測(cè)樣品濃度。先各組取10 μg 10%瓊脂糖SDS電泳和印跡，用肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)其表達(dá)水平。各組再取 200 μg上清與p38MAPK抗體1 μg于4℃孵育過夜，先取30 μg免疫沉淀樣品加入 20 μL 2×上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行10%瓊脂糖 SDS電泳和印跡，檢測(cè)p38MAPK水平。以p38MAPK抗體的積分吸光度值與β肌動(dòng)蛋白抗體的積分吸光度値的比值表示p38MAPK的表達(dá)水平。

1.5.2 放射免疫標(biāo)記方法測(cè)定p38MAPK活性

按1.5.1處理的部分沉淀的蛋白樣品先用50 μL蛋白G瓊脂糖孵育1 h，蛋白瓊脂糖珠用溫和裂解液洗滌3次，再用激酶緩沖液(mmol·L－1HEPES 20 pH 7.6，MgCl220，β-甘油磷酸20，對(duì)硝基苯磷酸二鈉20，Na3VO40.1，DTT 2)洗滌2次，取30 μL蛋白瓊脂糖珠加入總體積40 μL的激酶緩沖液中，和[32P]ATP 50 μmol·L－1(每皮摩爾ATP的cpm值為1500)和髓鞘質(zhì)堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)0.2 mg·L－1，振蕩混勻，30℃孵育30 min，各取10 μL反應(yīng)混合物滴在磷酸纖維素濾紙上終止反應(yīng)。先用0.85%的磷酸洗磷酸濾紙5×5 min，再用丙酮洗5 min。膜60℃干燥過夜后放入液閃瓶?jī)?nèi)，加入二甲苯閃爍液，底物結(jié)合的放射性通過液閃儀計(jì)數(shù)。p38MAPK的活性以MBP結(jié)合的cpm值表示。

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)磷酸化JNK水平和分布

N2a細(xì)胞以每孔5×105的密度接種在12孔板中，孵育24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%豐度時(shí)，去血清培養(yǎng) 12 h；再按正常組(等體積 DMSO)，CA 5.0 nmol·L－1，褪黑素50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1，Vit E 50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1給藥處理12 h后，細(xì)胞用冷PBS洗2次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗1次，體積分?jǐn)?shù)為0.003的Triton-X100破細(xì)胞膜5 min，BSA 10 g·L－1孵育1 h；細(xì)胞再與適當(dāng)稀釋的p-JNK抗體 (1∶250)在4℃孵育過夜，PBS洗4次；與二抗(熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記羊抗兔IgG)37℃孵育1 h；用PBS洗4次；用DAPI(0.1 mg·L－1)染核；用Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，Jena，德國(guó))并用543 nm激發(fā)光560 nm濾片和40X/0.75 M27目鏡攝像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞tau蛋白和MKK4/JNK磷酸化水平的影響

圖1A1和圖1A2顯示，與正常組相比，CA 2.5，5.0和10 nmol·L－1處理引起Ser422位點(diǎn)磷酸化tau蛋白水平顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，但CA 5與10 noml·L－1組間磷酸化tau蛋白水平并無(wú)差異，且各組總 tau水平無(wú)改變(圖略)。說明 CA 5 nmol·L－1是引起tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化的最適濃度。圖1B1和圖1B2顯示，與正常對(duì)照組相比，CA組tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平顯著升高(P＜0.01)，與CA組相比，同時(shí)給予褪黑素25，50和100 μmol·L－1tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平低(P＜0.01)，50 μmol·L－1組的磷酸化水平最低，說明褪黑素抑制CA誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化的最適濃度是50 μmol·L－1。圖1C1和圖1C2顯示，與正常對(duì)照組相比，CA處理顯著升高p-JNK/ JNK比值(P＜0.01)，同時(shí)給予褪黑素或Vit E使p-JNK/JNK比值低于CA組(P＜0.01)，說明JNK激活可能參與CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422過度磷酸化，褪黑素抑制CA誘導(dǎo)的JNK過度磷酸化激活可能參與其抑制tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化。圖1D1和圖1D2顯示，CA組的p-MKK4(Ser257/ Thr261)/MKK4比值顯著高于正常組(P＜0.01)，褪黑素組和Vit E組的此比率均顯著低于CA組(P＜0.01)，說明MKK4激活可能參與CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化激活和tau過度磷酸化，褪黑素和Vit E可抑制MKK4激活減輕CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化激活和tau過度磷酸化。

Fig.1 Effect of caIycuIin A(CA)and meIatonin(Mt) on phosphoryIation of tau at Ser422 site JNK and MKK4 by Western bIotting.In Fig.A1，lane 1:DMSO；lanes 2－4；CA 2.5，5 and 10 nmol·L－1for 12 h，respectively.In Fig.B1，lane 1:DMSO；lane 2:CA 5 nmol·L－1；lanes 3－5:CA 5 nmol·L－1＋melatonin 25，50 and 100 μmol·L－1，respectively.In Fig.C1 and Fig.D1，lane1:DMSO；lane 2:CA 5 nmol·L－1；lane 3:CA 5 nmol·L－1＋melatonin 50 μmol·L－1；lane 4:CA 5 nmol·L－1＋Vit E 50 μmol·L－1.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative results of A1，B1，C1 and D1，respectivelyn＝5.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with control group；＃＃P＜0.01，compared with CA group.

2.2 褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞MDA含量的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，CA處理組細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高，同時(shí)給予褪黑素或Vit E處理其MDA水平顯著低于CA組(P＜0.01)。說明CA可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，褪黑素和Vit E可顯著抑制CA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

Tab.1 Effect of meIatonin on maIondiaIdehyde(MDA) content of N2a ceIIs

2.3 褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞p38MAPK水平及活性的影響

圖2A的免疫印跡結(jié)果和半定量分析顯示，各組p38MAPK含量基本相等，各組p38MAPK磷酸化MBP結(jié)合的[32P]ATP的cpm值無(wú)顯著差異(圖2B)，說明各組p38MAPK活性無(wú)顯著差異，說明CA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激并不激活p38MAPK也不誘導(dǎo)其表達(dá)水平改變。

Fig.2 Effect of meIatonin(Mt)on p38-mitogen activated protein kinase(p38MAPK)expression by Western bIotting(A)and activity of p38MAPK by radioimmunobIotting(B)of N2a ceIIs treated with CA.A:Lane 1，DMSO；lane 2:CA 5 nmol·L－1，lane 3:CA 5 nmol·L－1＋Mt 50 μmol·L－1；lane 4:CA 5 nmo·lL－1＋Vit E 50 μmol·L－1n＝5.

2.4 褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞JNK水平和分布的影響

圖3的磷酸化JNK抗體免疫熒光成像結(jié)果顯示，正常N2a細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核較大呈橢圓形，磷酸化JNK均勻分布于胞漿和胞核(圖3A)；CA處理后大部分細(xì)胞體積顯著變小，細(xì)胞核較小呈馬蹄形，磷酸化JNK增多且聚集在胞核及其周圍(圖3B)；褪黑素和CA共處理組部分細(xì)胞體積較大，具有長(zhǎng)突起，細(xì)胞核大呈橢圓形，磷酸化JNK彌散分布于細(xì)胞核和胞漿，部分細(xì)胞核內(nèi)有JNK聚集，但比CA組顯色顯著減弱(圖3C)；Vit E和CA共處理組與褪黑素和CA共處理組呈相似變化(圖3D)。這進(jìn)一步證明激活JNK磷酸化參與CA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化，褪黑素和Vit E可部分拮抗CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化。

Fig.3 Effect of meIatonin on IeveI and distribution of phosphoryIated c-Jun N-terminaI kinases(p-JNK)of N2a ceIIs treated with CA by immunofIuorescnce. A:DMSO；B:CA 5 nmol·L－1；C:CA 5 nmol·L－1＋melatonin 50 μmol·L－1；D:CA 5 nmol·L－1＋Vit E 50 μmol·L－1.1:DAPI；2:p-JNK；3:merge.

2.5 抑制MKK4/JNK信號(hào)途徑對(duì)CA誘導(dǎo)的tau蛋白S422位點(diǎn)磷酸化的影響

圖4A1和圖4A2顯示，與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)給予SP600125 40 μmol·L－1預(yù)處理2 h組tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平和p-JNK水平無(wú)變化，但與 CA處理組相比，SP600125 5，10，20及40 μmol·L－1預(yù)處理組均顯著抑制CA誘導(dǎo)的S422位點(diǎn)磷酸化tau蛋白水平升高，且其抑制p-JNK水平升高的效應(yīng)呈濃度依賴性(r＝0.95，P＜0.01)，表明JNK磷酸化參與CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化。圖4B1和圖4B2顯示，單獨(dú)給予地昔帕明預(yù)處理組與正常對(duì)照組相比，tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化無(wú)變化，且p-MKK4和p-JNK水平也不改變；但與CA處理組相比，地昔帕明5，10和 20 μmol·L－1均顯著降低CA誘導(dǎo)的MKK4磷酸化、JNK磷酸化和tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平，且其抑制MKK4磷酸化的效應(yīng)呈濃度依賴性(r＝0.99，P＜0.01)。表明MKK4/JNK信號(hào)途徑激活參與CA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化。

Fig.4 Effect of CA on inhibiting MKK4/JNK transduction pathway on tau phosphoryIation at Ser422 site. A1.Lane 1:DMSO；lane 2:SP600125(40 μmol·L－1)；lane 3: CA 5 nmol·L－1，12 h，lanes 4－7；CA 5 nmo·lL－1treated for 12 h after SP600125 5，10，20，40 μmol·L－1pretreated for 2 h，respectively.B1.Lane 1:DMSO；lane 2:desipramine 20 μmol·L－1，lane 3:CA 5 nmol·L－1，12 h；lanes 4－6:CA 5 nmol·L－1treated for 12 h after desipramine 5，10，20 μmol·L－1pretreated for 2 h，respectively.A2 and B2 are the quantitative analysis of A1 and B1，respectively.n＝5.??P＜0.01，compared with control group；＃＃P＜0.01，compared with CA group.

3 討論

最近有報(bào)道預(yù)先腹腔注射褪黑素9 d可預(yù)防CA誘導(dǎo)的突觸素(synaptophysin)丟失和記憶保持障礙，及tau蛋白過度磷酸化[7]。AD患者腦皮質(zhì)突觸富含Ser422位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白，降低Ser422過度磷酸化的tau蛋白可顯著改善轉(zhuǎn)tau小鼠的記憶障礙[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，CA處理顯著升高Ser422位點(diǎn)磷酸化水平，褪黑素50 μmol·L－1對(duì)CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422過度磷酸化的保護(hù)作用最強(qiáng)。這說明褪黑素可抑制CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙烯醛可激活p38MAPK使tau蛋白在PHF-1識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化[11]，而CA可引起氧化應(yīng)激[6]。因此，推測(cè)CA可能在細(xì)胞內(nèi)引起氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化使p38MAPK激活。與此一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)CA引起細(xì)胞內(nèi)MDA水平升高，且褪黑素教Vit E更顯著地降低CA引起的MDA水平升高。然而，p38MAPK活性檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)CA不引起p38MAPK激活和蛋白水平改變。免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CA顯著增加p-JNK水平，并且p-JNK顯著聚集在核內(nèi)。這與報(bào)道慢性抑制PP-2A可誘導(dǎo)JNK信號(hào)途徑的活化一致[12]。根據(jù)MKK4是調(diào)節(jié)Ser422位點(diǎn)磷酸化的關(guān)鍵激酶和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的關(guān)鍵成分[13－14]，環(huán)境毒物甲基汞可使大腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激和通過激活MKK4和JNK引起小鼠大腦皮質(zhì)tau蛋白在Thr-205，Ser-396和Ser-422位點(diǎn)磷酸化水平增加[15－16]，推測(cè)CA可能是通過氧化應(yīng)激激活MKK4引起JNK磷酸化增加導(dǎo)致tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA確實(shí)引起細(xì)胞內(nèi)磷酸化MKK4水平顯著升高，褪黑素和Vit E降低細(xì)胞內(nèi)磷酸化MKK4水平。這說明MKK4激活可能參與CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化激活和tau過度磷酸化。JNK的特異性抑制劑SP600125和神經(jīng)鞘磷脂酶抑制劑地昔帕明單獨(dú)處理并不改變tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平，但SP600125處理后再用CA處理，或地昔帕明處理后再給予CA處理，二者均濃度依賴性地抑制CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化和tau蛋白Ser422位點(diǎn)的過度磷酸化，地昔帕明還抑制CA誘導(dǎo)的MKK4和JNK磷酸化，這證明MKK4/JNK信號(hào)途徑激活參與CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化。

本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可顯著對(duì)抗CA引起的與記憶密切相關(guān)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化水平升高，這與報(bào)道，褪黑素可減輕CA引起的tau蛋白過度磷酸化，突觸丟失和記憶障礙抑制及氧化應(yīng)激一致[17]。根據(jù)報(bào)道，褪黑素可通過其MT1和MT2受體抑制過氧化氫、谷氨酸和TNF誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡和p38MAPK和JNK1的磷酸化[18]。因此，褪黑素也可能通過結(jié)合N2a細(xì)胞上的MT1受體抑制CA誘導(dǎo)的JNK磷酸化參與其預(yù)防CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)過度磷酸化，因而不對(duì)JNK磷酸化產(chǎn)生過度抑制。因?yàn)榱字＜〈?激酶和(或)蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)途徑激活可負(fù)性調(diào)節(jié)JNK信號(hào)途徑[19]，而褪黑素可持續(xù)增加Akt的磷酸化激活A(yù)kt信號(hào)途徑[20]。因此，褪黑素也可能通過激活A(yù)kt抑制JNK信號(hào)途徑激活。

總之，本研究首次證明褪黑素對(duì)CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser422位點(diǎn)磷酸化過度增強(qiáng)有抑制作用，并證明褪黑素對(duì)抗CA誘導(dǎo)的MKK4和JNK磷酸化參與其對(duì)tau蛋白過度磷酸化和改善記憶障礙的機(jī)制。

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Inhibiton of JNK phosphoryIation invoIved in meIatonin′s protection of caIycuIin A-induced tau hyperphosphoryIation

LI Xia-chun1，WANG Zhi-qiang1，LIU Xiu-ping2
(1.Department of Pathophysiology，Medical School of Three Gorge University，Yichang 443002，China；2.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou310007，China)

OBJECTIVE To explore the mechanisms of tau hyperphosphorylation induced by calyculin A(CA)in neuroblastoma cells and the effect of melatonin.METHODS N2a cells were treated with CA 5 nmol·L－1，or CA with melatonin 50 μmol·L－1，or CA with vitamin E(Vit E)50 μmol·L－1for 12 h.The level of tau phosphorylation at Ser422(recognized by R145d antibody)site and the level of phosphorylated c-Jun N-terminal kinases(p-JNK)and phosphorylated mitogen-activated protein kinase kinase 4(p-MKK4)were detected with immunoblotting，the level of malondialdehyde(MDA)was assayed with fluorimetry，and the activity of p38-mitogen activated protein kinase(p38MAPK)was assayed by radioimmunobloting.RESULTS CA treatment increased the level of phosphorylated tau at Ser422 site(1.70±0.19，1.0，P＜0.01)，and melatonin attenuated the effect of CA(0.98±0.12，1.70± 0.19，P＜0.01).In addition，CA treatment increased the level of MDA(μmol·g－1protein:0.241±0.006，0.141±0.006，P＜0.01)and melatonin antagonized the increase of MDA induced by CA(μmol·g－1protein:0.172±0.004，0.193±0.005，0.241±0.006，P＜0.01).CA treatment increased the level of p-JNK (1.91±0.27，1，P＜0.01)and p-MKK4(1.81±0.09，1，P＜0.01)and melatonin antagonized the effect of CA induced increase of p-JNK(1.11±0.15，1.91±0.27，P＜0.01)and p-MKK4(1.14±0.06，1.81±0.09，P＜0.01)without changing the level or activity of p38MAPK.Both JNK inhibitor(SP600125)and MKK4/JNK transduction pathway inhibitor antagonized CA induced tau phosphorylation at Ser422 site and JNK phosphorylation.CONCLUSION Inhibiton of JNK phosphorylation is possibly involved in the protection of melatonin on CA-induced tau hyperphosphorylation at Ser422 site.

melatonin；calyculin A；tau phosphorylation；mitogen-activated protein kinase kinase 4

LI Xia-Chun，E-mail:lixiachun429＠aliyun.com，Tel:(0717)6397466

R963

:A

:1000-3002(2014)06-0830-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.003

2013-12-19 接受日期:2014-07-20)

(本文編輯:喬 虹)

李夏春，博士，副教授，主要從事阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制研究。

李夏春，E-mail:lixiachun429＠aliyun.com，Tel:(0717)6397466