曾 菊，程肖蕊，周文霞，張永祥，王仲孚，黃琳娟

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西西安 710069；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；3.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850)

糖組學(xué)研究技術(shù)進展

曾 菊1，2，3，程肖蕊2，3，周文霞2，3，張永祥2，3，王仲孚1，黃琳娟1

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西西安 710069；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；3.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850)

糖組學(xué)研究通常包括聚糖組的分離與純化、糖鏈組的分離和富集糖鏈的結(jié)構(gòu)解析和定量以及糖鏈的性質(zhì)和功能研究。根據(jù)糖蛋白組、蛋白聚糖組和糖脂組生物化學(xué)性質(zhì)的不同,可相應(yīng)采用分步沉淀法、硼酸親和法、二氧化鈦法、親和層析法、體積排阻法、凝膠過濾層析和柱層析法等進行分離與純化,進而通過植物凝集素、親水色譜和固相萃取等技術(shù)富集高純度且特異性的糖鏈。通過凝集素芯片技術(shù)、各種生物質(zhì)譜及其聯(lián)用并輔以糖鏈的衍生化標(biāo)記對糖鏈進行結(jié)構(gòu)解析,并用同位素標(biāo)記法和代謝標(biāo)記法對糖鏈進行相對定量。最后,借助糖鏈結(jié)構(gòu)解析軟件工具及糖鏈相關(guān)數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析,可對糖鏈的生物學(xué)功能進行更全面的解析。本文對復(fù)合糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及糖組生物信息研究方法進行了綜述。

糖組；糖組學(xué)；糖蛋白；蛋白聚糖；糖脂

糖類成分根據(jù)分子大小可分為單糖、寡糖、多糖及復(fù)合糖，大分子糖鏈可單獨存在，但在生物體主要以復(fù)合糖的形式存在，即糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂。復(fù)合糖的糖鏈合成是由糖基的供體、受體和糖基轉(zhuǎn)移酶三者相互協(xié)調(diào)完成，而其降解則靠糖苷水解酶，因此，糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶的表達和活性在很大程度上調(diào)控著復(fù)合糖的狀態(tài)。糖蛋白通常有N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖糖基化和磷脂酰肌醇錨蛋白4種類型。蛋白聚糖是以糖胺聚糖為主通過共價鍵與若干肽鏈連接的化合物。糖脂則是通過糖的還原末端以糖苷鍵與脂類連接起來的化合物，通常包括分子中含鞘氨醇或甘油酯的鞘糖脂、由磷酸多茚醇或類固醇衍生的糖脂4類。糖組(glycome)是一個生物體、一個器官、一種特定組織或某個細胞、細胞器在某一條件所具有的整套(全部)聚糖。高等動物的糖組可分為糖蛋白糖組、蛋白聚糖糖組和糖脂糖組。糖組學(xué)(glycomics)則是研究糖組結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)，糖組學(xué)研究包括聚糖組(糖蛋白組、蛋白聚糖組和糖脂組)的分離與純化、糖鏈組(糖蛋白糖鏈組、蛋白聚糖糖鏈組和糖脂糖鏈組)的分離、糖鏈的結(jié)構(gòu)解析和定量及糖鏈性質(zhì)和功能的研究。糖組學(xué)的研究離不開糖組研究技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于糖組研究技術(shù)的綜述報道已有多篇[1－6]，但均是關(guān)于糖蛋白或其糖鏈分析的研究，關(guān)于蛋白聚糖和糖脂的研究方法甚少。本文不僅對糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂的分離純化及其糖鏈的分離、結(jié)構(gòu)分析及定量等研究方法進行了綜述，而且對糖組的生物信息學(xué)研究方法進行了綜述，可為研究者全面了解糖組學(xué)研究方法提供參考。

1 聚糖組的分離與純化

從生物樣品中分離和純化聚糖組，需要根據(jù)所需的目標(biāo)糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂特有的生物化學(xué)性質(zhì)來進行。

1.1 糖蛋白組

糖蛋白組的分離首先是將總蛋白從生物樣品如組織或血液等中分離出來，其次是將糖蛋白從提取分離的總蛋白中分離出來，用于后續(xù)的研究。糖蛋白兼有多糖和蛋白質(zhì)的性質(zhì)，大多可溶于水、稀酸或稀堿溶液，可根據(jù)需要用不同的溶劑進行提取分離。

可利用糖蛋白特有的性質(zhì)將糖蛋白與非糖蛋白進行分離。如游離糖、單糖和寡糖可與凝集素特異結(jié)合，可使用親和層析法分離[7]，但其缺點在于只能針對具備特定結(jié)構(gòu)的糖鏈。二維凝膠電泳結(jié)合熒光染色技術(shù)可將糖氧化成醛后易于熒光標(biāo)記[8]，進而進行分離；該檢測方法比較直觀，能針對大部分糖鏈，但糖鏈結(jié)構(gòu)容易被破壞，不能進行糖鏈組成分析。因為蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑變性而不溶于水，糖則與色素結(jié)合后易被二乙氧乙基(DEAE)-纖維素吸附，所以可采用Sevage法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法和脫色素法等將糖蛋白與非糖蛋白進行分離。

從糖蛋白中純化特定類型的糖蛋白，需根據(jù)糖蛋白的性質(zhì)采用不同的方法。如獲取不含無機鹽等小分子雜質(zhì)的糖蛋白可用透析法；獲取特定溶解度的糖蛋白可用乙醇、硫酸銨、丙酮進行分級分離的分步沉淀法；獲取酸性和中性糖蛋白可用季胺鹽沉淀法，如十六烷基三甲基溴化銨、十六烷基吡啶沉淀法等；獲取特定分子直徑的糖蛋白可用濾膜超濾法；獲取特定分子質(zhì)量和等電點的糖蛋白可用區(qū)域電泳法。

富集血清樣品中混合的糖肽和非糖肽可用硼酸親和法。硼酸配基幾乎可與所有含順式二醇結(jié)構(gòu)的化合物發(fā)生親和作用，而糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)中幾乎都含有順式鄰位羥基，因而硼酸親和技術(shù)可有效富集含順式二醇的糖蛋白。硼酸功能化的介孔硅膠材料對于富集血清樣品中混合的糖肽和非糖肽具有良好的選擇性，具有較高的收率[9]。

含唾液酸的糖蛋白和糖肽的分離富集可用二氧化鈦法。二氧化鈦是一種兩性物質(zhì)，可通過控制pH值達到富集目的。唾液酸化的糖蛋白和糖肽的羧基和羥基帶有負電，為 Ti4＋提供了結(jié)合配基，Palmisano等[10]從817個唾液酸化的糖蛋白中鑒定得到1632個唾液酸化糖肽。

體積排阻法用于糖蛋白的分離，其原理是基于含有糖鏈的糖蛋白相對分子質(zhì)量稍大于非糖蛋白的特點。因此，該方法對糖鏈結(jié)構(gòu)無偏向性，若只需獲得糖蛋白則不需要衍生化及多次分離，操作簡單，但缺點是并不能分離得到所有的糖蛋白，相對分子質(zhì)量小于非糖蛋白的糖蛋白會被排出，同時相對分子質(zhì)量較大的非糖蛋白則會留在分離得到的糖蛋白樣品中。相對于此無特異性的分離方法，Klement等[11]將傳統(tǒng)用于N-鏈接的糖蛋白分離的酰肼化學(xué)法予以改進，增加高碘酸鈉的氧化時間并升高氧化溫度，基于酰肼微球?qū)崿F(xiàn)了對O-鏈接的糖蛋白的特異性分離富集。

1.2 蛋白聚糖組

蛋白聚糖是一類特殊的糖蛋白，除含有糖胺聚糖外，還有一些O-連接或N-連接的寡糖鏈。根據(jù)所含糖胺聚糖鏈的多少，存在于細胞外基質(zhì)的蛋白聚糖可分為大分子型和小分子型。由于蛋白聚糖的分子結(jié)構(gòu)及分子間相互作用復(fù)雜且呈多樣性，故現(xiàn)在還沒有一種分離方法能適用于所有的蛋白聚糖的分離。這也是蛋白聚糖組研究少有進展的原因之一。分離純化蛋白聚糖方法與糖蛋白的純化方法基本一致。但由于蛋白聚糖中糖胺聚糖含量多，親水性強，及其分子具有微觀不均一性，凝膠電泳對蛋白聚糖的分離不能達到理想的效果[12]，故利用不同孔徑的凝膠過濾層析來分離蛋白聚糖[13]，如聚集蛋白聚糖(aggrecan)和基底膜蛋白聚糖(perlecan)可用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500或S-1000、瓊脂糖凝膠CL-2B來分離；核心蛋白聚糖(decorin)和雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)，部分降解的蛋白聚糖等可用Superose-6分離；此外，膜聯(lián)蛋白(annexin)和半乳糖凝集素對糖胺聚糖有特異識別[14]，可用凝集素親和色譜對含膜聯(lián)蛋白糖胺聚糖進行分離。

1.3 糖脂組

真核生物糖脂中，含鞘氨醇或甘油酯的鞘糖脂因與人類生命活動及生物、醫(yī)藥關(guān)系更為密切，是糖脂研究的主要類型。從生物樣品(如組織和體液)中提取含鞘氨醇或甘油酯的鞘糖脂，可首先從生物樣品中提取總脂肪，然后根據(jù)鞘糖脂既具有極性的羥基和羧基，又具有疏水性的脂肪鏈，既可聚集溶于水中，又能溶于氯仿-甲醇混合液中的性質(zhì)，再從總脂肪中提取鞘糖脂，可采用大孔吸附樹脂柱層析法[15]、柱層析色譜法、薄層層析印跡法、高效液相色譜和逆流色譜[16]等。從糖脂中純化特定類型的鞘糖脂，可通過DEAE-Sephadex A-25、硅膠柱層析及薄層層析、基于支持液-液分離系統(tǒng)的逆流色譜、離心分配色譜和液滴逆流色譜等進行[16]。

2 糖鏈組的分離和富集

將糖鏈從糖蛋白、蛋白聚糖或糖脂(或鞘糖脂)上有效分離下來并進行高效富集，以及糖鏈結(jié)構(gòu)的解析和定量是糖組學(xué)研究中闡明其生物學(xué)功能的重要基石。

2.1 糖鏈的分離

N-糖基化和O-糖基化是糖基化最常見的兩種形式，也是糖組中研究的主要對象。對于N-糖鏈的分離，常用的方法有化學(xué)法和酶法。對O-糖鏈的分離常用化學(xué)法，由于O-糖鏈結(jié)構(gòu)多樣，目前仍然缺乏能夠特異性地切割O-糖鏈的糖苷酶。內(nèi)切α-N-乙酰半乳糖胺酶可識別O-糖鏈中乙酰半乳糖與半乳糖之間的連接[17]。化學(xué)法中肼解法和還原性β-消除法[18]，常分別用于N-糖鏈和O-糖鏈的釋放。在此基礎(chǔ)上，本課題組建立了不同于傳統(tǒng)的β-消除反應(yīng)一鍋法[19]，用于O-糖鏈的釋放。相對于傳統(tǒng)的β-消除反應(yīng)，一鍋法在同一體系中同時對O-糖鏈進行非還原性解離和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化標(biāo)記，有效簡化了實驗過程。一鍋法用氨水代替氫氧化鈉溶液提供O-糖鏈解離的堿性環(huán)境，其優(yōu)勢在于氨水易揮發(fā)除去，PMP在溫和堿性條件下可使解離下來的O-糖鏈的還原性末端衍生化帶上發(fā)色基團，且糖鏈的完整性也得到了保護。此外，三氟乙酸[20]和三氟甲磺酸[21]也可水解糖蛋白上連接的糖鏈，但會對糖鏈造成不同程度的損傷，所以通常不用于糖鏈的解離。酶法是利用特異性的內(nèi)切酶在復(fù)合糖的特異部位進行切割獲得所需糖鏈。常用于N-糖鏈解離的酶有糖肽酶A、肽N-糖苷酶F(peptide-N-glycosidase F，PNGase F)[22]、內(nèi)切β-N-乙酰葡萄糖胺酶H。用PNGase F切斷糖鏈與天冬酰胺間的糖肽鍵釋放N-糖鏈?zhǔn)亲钇毡榈姆椒?。該方法反?yīng)條件溫和、效率高，能夠在溶液中或直接在一維或二維電泳的凝膠中進行膠內(nèi)酶切，但PNGase F對于與肽段直接相連的N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)上發(fā)生α-1-3巖藻糖基化的 N-糖鏈不起作用，需要用PNGase A進行酶切[22]。酶法也受一定的限制，因為并不是所有的糖鏈都有其對應(yīng)的酶。

2.2 糖鏈的富集

為了制備可用于結(jié)構(gòu)解析的糖鏈，要對目標(biāo)糖鏈進行富集以增強其檢測信號。各種糖鏈的富集方法各有利弊，要根據(jù)所分析目標(biāo)物的特點進行選擇，同時可將多種糖鏈富集方法聯(lián)合使用，以達到最好的富集效果。

2.2.1 植物凝集素

一些游離糖、單糖和寡糖可與植物凝集素(lectin)特異結(jié)合，通過不同凝集素柱可直接富集得到目標(biāo)糖鏈(表1)，但缺點在于不是每一種糖蛋白都能找到與其對應(yīng)的凝集素。Zielinska等[23]用刀豆凝集素，荊豆凝集素和 蓖麻凝集素3種凝集素對幾種模式生物N-糖基化糖蛋白進行富集，鑒定了6種模式生物中上千個N-糖基化位點，發(fā)現(xiàn)真核生物的N-糖蛋白組都有不變的特征，包括序列識別模式、結(jié)構(gòu)限制和亞細胞定位。

表1 能與單糖特異結(jié)合的凝集素

2.2.2 親水色譜法

因糖鏈具有較強的親水性，從而可利用這一特性對其進行富集。親水色譜的固定相是具有強親水性的極性吸附劑，流動相是水或有機溶劑[24]。將與待純化樣品有專一可逆結(jié)合的配基連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑并裝柱，使混合物通過親和柱，純化對象被吸附而其他物質(zhì)隨流動相流出，再用緩沖液將純化的目標(biāo)物質(zhì)洗脫下來從而達到富集的目的。如 Hua等[25]用石墨炭柱和石墨烯、Karg等[26]采用纖維素和瓊脂糖來有效富集糖鏈。

2.2.3 弱陰離子交換色譜

弱陰離子交換色譜基于糖鏈所帶有的帶電基團對其進行富集[27]，如唾液酸或羧基所具有的陰離子。在進行富集時，糖鏈中單糖的數(shù)目會影響保留時間，在帶電基團數(shù)目相同的情況下糖單位數(shù)目多的糖鏈保留時間短。為避免在檢測混合樣品時相似聚糖會共流出峰，Kalay等[28]使用弱陰離子交換-HPLC根據(jù)樣品中唾液酸的含量，進行輕度去唾液酸而將其分開。

2.2.4 固相萃取技術(shù)

固相萃取是由色譜理論發(fā)展的一種固-液相萃取的物理過程。樣品中目標(biāo)成分通過溶劑流通被吸附在固相上，而其他雜質(zhì)則隨溶劑流出，再通過合適的洗脫劑將目標(biāo)成分洗脫下來，獲得所需目標(biāo)成分。現(xiàn)常用石墨碳固相萃取小柱和C18小柱富集純化糖鏈。C18小柱用鍵合硅膠C18做填料為反相吸附劑，石墨碳小柱填料即為活性炭，二者常用于分離糖鏈與蛋白質(zhì)及除去鹽等雜質(zhì)。

3 糖鏈的結(jié)構(gòu)解析和定量

對于糖組學(xué)的研究，獲取某一特定類型糖鏈組中所含有的所有糖鏈結(jié)構(gòu)和含量信息是其核心內(nèi)容。因此，解析合適濃度和合適純度糖鏈組中的糖鏈結(jié)構(gòu)并對其進行定量分析的技術(shù)和方法至關(guān)重要。

3.1 結(jié)構(gòu)解析

對于糖鏈結(jié)構(gòu)的解析，生物質(zhì)譜、核磁共振、色譜技術(shù)、凝集素芯片等技術(shù)是重要手段。

3.1.1 生物質(zhì)譜

基于物理手段的主要有生物質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振技術(shù)[29]。用于糖組學(xué)的生物質(zhì)譜目前主要有電噴霧電離質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行質(zhì)譜[26，30]、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等。

為了提高質(zhì)譜解析的靈敏度，通常需要對待測糖樣品進行衍生化。全甲基化和還原氨化法是最常使用的衍生化方法。全甲基化常用碘甲烷等試劑，使糖鏈上高極性的OH-，NH-和COOH-變?yōu)榉菢O性的OCH3-，NCH3-和COOCH3-，增加了質(zhì)譜分析的靈敏性。此衍生還可使中性和酸性聚糖在基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行質(zhì)譜正離子模式下同時被檢測出。新近產(chǎn)生的將氫氧化鈉填充在毛細管或純化柱中的固相全甲基化，增加了其衍生化分析的再現(xiàn)性，此方法已成功用于定量分析不同癌癥間相關(guān)的糖組的變化，如食管癌[31]和卵巢癌[32]。還原氨化法所用的衍生化試劑都帶有一個活性伯氨基或肼基，可在酸催化的條件下與糖鏈還原端自由醛基縮合生成希夫堿，而希夫堿的雙鍵被硼氫氰化鈉(NaBH3CN)還原為穩(wěn)定的單鍵。此類衍生化試劑常見的有2-氨基吡啶、氨基苯甲酰胺、對氨基苯甲酸乙酯、1-氨基吡-3，6，8-三磺酸、8-氨基萘-1，3，6-三磺酸和2-氨基苯甲酸等[33]。對糖鏈進行衍生化，增強其疏水性，不僅消除了中性和酸性糖之間不同的電離效率而且促進了質(zhì)譜的分離效率。

另外，為了提高質(zhì)譜解析的效率和準(zhǔn)確性，通常在質(zhì)譜解析前，采用分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用將待測糖樣品進行進一步預(yù)分離純化。如毛細管電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可以用于細胞、組織內(nèi)低豐度糖蛋白、蛋白聚糖中糖鏈的結(jié)構(gòu)分析，其優(yōu)勢在于進樣量少、靈敏度高，與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合外切糖苷酶可獲得每個聚糖的定位和結(jié)構(gòu)。又如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用就在糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方面具有獨特優(yōu)勢，將糖鏈全甲基化、乙?；蛉谆杳鸦筮M行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析可確定糖鏈內(nèi)部單糖間的連接方式。

3.1.2 凝集素芯片技術(shù)

基于芯片的原理，發(fā)明了用于糖組研究的糖芯片，能以高通量的方式提供糖結(jié)構(gòu)信息。其中，凝集素芯片是發(fā)展較快的芯片技術(shù)。通常是將各種植物凝集素以一定的空間距離固定在固體支持物上，再用熒光標(biāo)記的樣本與芯片上的凝集素反應(yīng)，標(biāo)記的樣本通過自身糖鏈和固定的凝集素實現(xiàn)特異識別，然后通過芯片掃描儀分析熒光的強度來確定樣品的糖結(jié)構(gòu)。如吲哚類菁染料Cy3和Cy5，這類染料可以與賴氨酸結(jié)合，因此把糖蛋白的蛋白部分標(biāo)記后并不影響其糖鏈部分與凝集素的親和。簡強等[34]對實驗條件進行了優(yōu)化，將刀豆凝集素和雪蓮花凝集素固定于環(huán)氧化修飾的玻片表面，用Cy3標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白核糖核酸酶B，利用凝集素識別特異糖鏈的原理建立凝集素芯片檢測糖蛋白的方法，初步檢測分析了正常肝細胞總蛋白中糖蛋白的糖鏈構(gòu)成。

3.2 結(jié)構(gòu)注解

隨著糖組學(xué)研究的不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者通過實驗驗證建立起了相當(dāng)多的高可信度結(jié)構(gòu)注釋數(shù)據(jù)庫。表2中列舉了一些網(wǎng)絡(luò)資源信息，如SWEET-DB，CFG和KEGG都是關(guān)于糖鏈結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫。

為便于數(shù)據(jù)分析，學(xué)者們也開發(fā)了許多注解軟件工具用于分析糖鏈結(jié)構(gòu)。如Cartoonis是第一個基于質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)自動注解N-糖鏈的軟件工具[35]，GlycoPeakFinder是基于串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的軟件，GlycoPep DB是用于分析糖肽的軟件，這些軟件都可以快速完成對糖鏈質(zhì)譜數(shù)據(jù)的自動化歸屬。Mechref等[36]研發(fā)了一種開放資源型軟件MultiGlycan，是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行質(zhì)譜和液質(zhì)聯(lián)用的糖定量分析的軟件工具。Vakhrushev等[37]開發(fā)了SysBioWare軟件對原始聚糖質(zhì)譜進行處理和注釋。由Kronewitter等[38]開發(fā)的Glycolyzer軟件，集成了一套工具能從原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中識別聚糖峰信息，與SysBioWare相似。另外，還有 GlycosidIQ[35]，Oscar[35]，GLych[35]，peptoonist[35]和Glyco-Workbench等軟件可對糖鏈質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理及自動化歸屬其結(jié)構(gòu)類型。表3列舉了一些軟件的應(yīng)用范圍。每種軟件都有自己的適用范圍和局限性，所以在使用這些軟件前應(yīng)充分了解其算法特點，并對其歸屬結(jié)果進行最終的人工篩選和確定。

目前，借助生物信息學(xué)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)糖譜已成為樣品糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定的主要工具，是糖組學(xué)分析技術(shù)中不可或缺的，它為糖鏈結(jié)構(gòu)的測定和新糖鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)提供了強大的技術(shù)支持。但由于缺乏一致的算法，各個數(shù)據(jù)庫的相關(guān)數(shù)據(jù)不能實現(xiàn)共享，其強大功能的發(fā)揮還有賴于相關(guān)應(yīng)用軟件、數(shù)據(jù)庫資源和計算機網(wǎng)絡(luò)的建立、發(fā)展和完善。

3.3 定量研究

糖組學(xué)的研究除了要獲得不同生物樣品中糖的種類和結(jié)構(gòu)信息外，非常重要的信息還包括同種或(和)不同種糖在不同生物樣品中的含量高低，這在生物標(biāo)志物和疾病診斷中極其重要。對于糖組的定量研究包括絕對定量和相對定量研究，通常與結(jié)構(gòu)解析同步進行。

絕對定量需要獲得≥1待測糖樣品中某種糖或所有糖的絕對含量。絕對定量需要待測物的標(biāo)準(zhǔn)品，因生物體中糖鏈的組成復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得，故對糖鏈的絕對定量分析目前尚無較為成熟的方法。相對定量則不要求獲得待測糖樣品中某種糖的絕對含量，只需獲得≥2個待測樣品中某種糖或所有糖的含量的差值即相對含量。相對定量常用內(nèi)標(biāo)法，如同位素標(biāo)記法和代謝標(biāo)記法。

表2 用于糖鏈結(jié)構(gòu)注解的數(shù)據(jù)庫

表3 用于糖鏈結(jié)構(gòu)注解的軟件

3.3.1 穩(wěn)定同位素標(biāo)記法

對糖鏈進行化學(xué)衍生后用穩(wěn)定同位素標(biāo)記，結(jié)合質(zhì)譜對其進行相對定量分析。對不同樣品糖鏈進行標(biāo)記，再將其按比例混合進行質(zhì)譜分析，相同的糖鏈因所帶同位素質(zhì)量不同而產(chǎn)生一對特征峰，對不同來源的同種糖鏈之間的豐度進行比對，從而達到相對定量。全甲基化或還原胺化衍生與同位素標(biāo)記通過液質(zhì)聯(lián)用進行糖鏈的定量研究是目前應(yīng)用較多的方法。全甲基化結(jié)合同位素標(biāo)記的優(yōu)點是便于多種質(zhì)譜檢測，但缺點在于其要求甲基化效率必須相同，但由于寡糖中存在許多羥基、羧基和氨基，要得到準(zhǔn)確的定量就需使甲基化效率完全相同是比較困難的。Wells等[40]用[13C]H3I和[12C]H3I對不同時期黑腹果蠅的糖鏈進行相對定量研究，發(fā)現(xiàn)一些源于早期胚胎的聚糖隨著生長有明顯的減少。Zaia等[41]將還原氨試劑與不同數(shù)目的氘原子進行結(jié)合用4種不同的標(biāo)簽方式(＋0，＋4，＋8，＋12)進行標(biāo)記，再通過質(zhì)譜對4種樣品中的硫酸軟骨素蛋白多糖、肝素和源于酸性糖蛋白的N-糖鏈進行了相對定量，這是第一個用于對四鏈聚糖進行定量分析的試劑。但此方法在檢測中也有一定缺陷，對樣品進行標(biāo)記后試劑會使質(zhì)量位移產(chǎn)生4 U的差異，由于同位素分布差異較小會造成同位素分布區(qū)域的重疊，這樣就會涉及到后續(xù)對正確的四鏈聚糖離子豐度的理論模擬提取。此外，氘的引入在檢測中可能會導(dǎo)致色譜行為發(fā)生轉(zhuǎn)變，引起離子化和質(zhì)譜圖方面產(chǎn)生差異。薛向東等[42]對母乳中游離寡糖和牛奶中游離寡糖分別進行d0/d5(不含“氯”的苯胺/含5個“氯”的苯胺)苯胺穩(wěn)定同位素標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)母乳中的乳糖含量高于牛奶、母乳游離寡糖比牛奶游離寡糖種類復(fù)雜，且?guī)r藻糖基化程度高。另外，12[C6]-苯胺和13[C6]-苯胺也已用于糖胺聚糖的相對定量[43]。

3.3.2 代謝標(biāo)記法

己糖合成中谷氨酰胺側(cè)鏈氨基上的氮是GlcNAc、N-乙酰 半乳糖糖胺 (N-acetylgalactosamine，GalNAc)和唾液酸生物合成中唯一的氮源，在培養(yǎng)基中加入重氮標(biāo)記的酰胺-[15N]-Gln便可在代謝過程中將15N標(biāo)記到細胞中所有的氨基糖上，則N-和O-連接的聚糖、糖脂以及在細胞外基質(zhì)的蛋白聚糖中的每個氨基糖均增加1 U。通過對分別加入輕重兩種谷氨酰胺培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的糖蛋白糖鏈質(zhì)譜檢測的同位素標(biāo)記的對峰的信號強度進行比較即可進行定量，這種方法稱為含谷氨酰胺氨基糖的同位素檢測法。Orlando等[44]利用GlcNAc、GalNAc和唾液酸生物合成的基本路徑，開發(fā)了上述檢測方法，即將小鼠干細胞在含酰胺-[15N]-Gln的混合介質(zhì)中培養(yǎng)72 h以使細胞中聚糖得以標(biāo)記，通過MS和MS/MS檢測對其N-和O-糖鏈進行了成功的定量分析。

4 糖鏈的性質(zhì)和功能研究

糖組中結(jié)構(gòu)清楚、含量準(zhǔn)確、理化性質(zhì)明確的某種糖或所有糖所具有的生物學(xué)功能一直是生命科學(xué)領(lǐng)域最為關(guān)注的問題，也是從基礎(chǔ)走向應(yīng)用的關(guān)鍵問題。為了能有效解決結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系，人們基于DNA芯片的原理建立了糖微陣列技術(shù)[45]，即將大量的寡糖序列以點陣形式固定在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，如共價連接單糖或二糖微陣列、非共價吸附多糖微陣列及寡糖微陣列等。可用于解決聚糖與其他生物分子間的相互作用及作用機制等問題，還可用于發(fā)現(xiàn)與聚糖相關(guān)的生物標(biāo)記物。如Aranzamendi等[46]通過糖微陣列技術(shù)從上百種不同的糖抗原中篩選出能與感染旋毛蟲病個體的抗體結(jié)合的抗原。

目前，在臨床診斷方面，一些巖藻糖化和唾液酸化的糖鏈被人們廣為關(guān)注。臨床研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者體內(nèi)，巖藻糖苷酶活性異常，其與肝癌細胞中含巖藻糖的糖鏈結(jié)構(gòu)的改變密不可分[47]。α1-抗胰蛋白酶和α-甲胎蛋白的核心巖藻糖基化的增加已經(jīng)成為肝癌預(yù)測與診斷的指標(biāo)之一。含巖藻糖-α(1-2)-半乳糖的聚糖在認知過程中具有不可忽視的作用[48]。前列腺特異性抗原在早期前列腺癌患者血清中的表達水平升高，但在良性前列腺增生中也存在該現(xiàn)象，α-1，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中高表達[49]。因此，人們通過前列腺特異抗原糖基化結(jié)構(gòu)的變化進一步區(qū)分良性和惡性前列腺疾病。唾液酸也會因疾病的發(fā)生和發(fā)展而改變，由唾液酸殘基形成的糖鏈——多聚唾液酸附著在神經(jīng)細胞黏附因子上，在細胞間黏附、細胞遷移、神經(jīng)發(fā)育和重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[50]。α-(2，3)/(2，6)連接的唾液酸在肝癌中占有很高比例，不同連接方式唾液酸的分布有望成為不同類型肝病診斷的重要標(biāo)志之一[51]。另一方面，將特異存在的糖基化位點或糖鏈作為靶標(biāo)開發(fā)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物也具有一定的臨床意義。

5 展望

糖組學(xué)的研究完全依賴于糖組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，糖組學(xué)技術(shù)近年來已取得明顯進展，有力地促進了糖組學(xué)的發(fā)展。但因糖鏈本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在技術(shù)上仍然面臨許多問題需要解決，如糖鏈的結(jié)構(gòu)分析和共價鍵的確定仍是低通量的工作，尚缺乏快速、大量測定細胞所有糖鏈結(jié)構(gòu)的技術(shù)，在糖鏈的性質(zhì)和功能研究尤其是功能研究方面進展緩慢。上述問題的解決尚需研究者艱苦卓絕的努力。

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Progress in technoIogy for gIycomics

ZENG Ju1，2，3，CHENG Xiao-rui2，3，ZHOU Wen-xia2，3，ZHANG Yong-xiang2，3，WANG Zhong-fu1，HUANG Lin-juan1
(1.Ministry of Education Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China，College of Life Sciences，Northwest University，Xi′an 710069；2.Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology，Beijing 100850，China；3.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Beijing100850，China)

Technologies for glycomics usually involve methods for separation and purification of polysaccharides，and separation，structure resolution，quantification，property investigation and function comment of glycan chains.Because of the different biochemical properties of glycoproteins，proteoglycans and glycolipids，the separation and purification of polysaccharides involve corresponding fractional precipitation，boric acid affinity，titanium dioxide，affinity chromatography，size exclusion method，and gel filtration chromatography column chromatography methods.The lectins，water affinity chromatography，solid phase extraction and other technologies could be applied to the oil enrichment of high pure and specific glycan chains.The structure of glycan chains can be analyzed using lectin microarray technology，mass spectrometry，and derivatization markers of glycan chains.Isotope labelling and metabolic labeling can be used to quantify glycan chains.The glycan biological function can be better understood using glycan chain structure analysis software and database of glycan chains by bioinformatics.

glycome；glycomics；glycoprotein；proteoglycan；glycolipid

ZHOU Wen-xia，Tel:(010)66931625，E-mail:zhouwx＠bmi.ac.cn，HUANG Lin-juan，E-mail:Huanglj＠nwu.edu.cn

R965

:A

:1000-3002(2014)06-0923-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.016

Foundation item:The project supported by Major Science Foundation of China(2012ZX09301003-002-001)；and Major Science Foundation of China(2013ZX09508104)

2014-05-26 接受日期:2014-10-23)

(本文編輯:齊春會)

國家科技重大專項(2012ZX09301003-002-001)；國家科技重大專項(2013ZX09508104)

曾 菊(1989－)，女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究；周文霞(1968－)，女，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥和神經(jīng)免疫藥理學(xué)研究；黃琳娟(1969－)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖生物學(xué)與糖工程研究。

周文霞，Tel:(010)66931625，E-mail: zhouwx＠bmi.ac.cn；黃琳娟，E-mail:Huanglj＠nwu.edu.cn