李丹，初陽，楊倩

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院藥劑科，沈陽110020；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽110001；3.沈陽藥科大學(xué)藥劑教研室，沈陽110024）

茶多酚在大鼠腸道的吸收動(dòng)力學(xué)研究

李丹1，初陽2，楊倩3

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院藥劑科，沈陽110020；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽110001；3.沈陽藥科大學(xué)藥劑教研室，沈陽110024）

目的研究茶多酚在腸道中的吸收部位和吸收機(jī)制。方法分別通過對(duì)大鼠的十二指腸、空腸、回腸進(jìn)行在體腸吸收實(shí)驗(yàn)，用紫外分光光度法測定茶多酚的含量，計(jì)算出茶多酚的表觀吸收系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka，反映茶多酚的吸收部位和吸收機(jī)制。結(jié)果灌流速度不同，Ka和Papp有顯著差異（P＜0.05）；藥物濃度不同，Ka和Papp無顯著差異（P＞0.05）；在相同的灌流速度及質(zhì)量濃度下，茶多酚在大鼠不同腸段的吸收速率常數(shù)Ka和表觀吸收系數(shù)Papp無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論茶多酚的吸收不受其質(zhì)量濃度的影響，茶多酚在全腸段吸收情況較差，制劑時(shí)應(yīng)考慮增加茶多酚的脂溶性。

在體腸吸收；茶多酚；單相灌流法；紫外分光光度法；大鼠

茶為山茶科灌木或小喬木植物，其干燥葉為茶葉Camellia sinensis（L.）O.Kuntze。茶起源于中國，作為保健飲品已有數(shù)千年歷史［1］。世界上現(xiàn)存最早的藥典《新修本草》首次詳細(xì)記載了茶的性味及功效：“茗，苦茶，味甘、苦，微寒，無毒，主痰瘡，利小便，去淡渴，令人少睡，秋采之。主下氣，消宿食［2］”。茶葉巨大的生物學(xué)價(jià)值已經(jīng)逐漸成為各界學(xué)者的研究熱點(diǎn)。研究表明，茶葉中含有大量的多酚類化合物、氨基酸、多糖類物質(zhì)、咖啡堿及多種維生素和礦物質(zhì)［3］，其中以茶多酚含量最多，約占茶葉總量的30%。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抗高血脂、防治動(dòng)脈粥樣硬化和抗病毒等藥理學(xué)活性［4］。然而目前并未見有關(guān)茶多酚在體腸吸收的相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討茶多酚的在體腸吸收情況，為茶多酚處方設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶多酚提取物（湖北綠源生物技術(shù)有限公司）；UV-9100紫外-可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；BSA124S型電子分析天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；HL-2恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g（沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物中心提供），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制：（1）空白灌流液［5］—K-R試液：稱取CaCl20.37 g，KCl 0.35 g，NaCl 7.8 g，MgCl20.02 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g和葡萄糖1.4 g，加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，備用。（2）酒石酸亞鐵溶液：將C4O6H2KNa 5 g和FeSO41 g加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。（3）pH7.5磷酸鹽緩沖液Na2HPO4溶液（溶液A）：將23.377 g Na2HPO4加水溶解，并定容至1 000 mL；KH2PO4溶液（溶液B）：精密稱取9.078 g KH2PO4，加水溶解并定容至1 000 mL；取85 mL溶液A和15 mL溶液B混合均勻，即得pH7.5磷酸鹽緩沖液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作：為消除實(shí)驗(yàn)過程中管路可能對(duì)藥物產(chǎn)生的吸附作用，實(shí)驗(yàn)前需用供試液沖洗管路，直至出液口藥物濃度與供試液濃度相同。大鼠禁食12 h，自由飲水，腹腔注射20%烏拉坦（劑量10 mL·kg-1）麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。沿腹中線打開大鼠腹腔，分離待考察腸段，兩端切口并用37℃生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈，插管后結(jié)扎。將浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋在傷口處保濕，同時(shí)用紅外燈照射進(jìn)行保溫。進(jìn)口處用裝有供試液的小瓶進(jìn)行灌流，開始計(jì)時(shí)后預(yù)平衡30 min，之后每隔15 min在出口處用另一重量已知的小瓶收集1次，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間105 min。分別于計(jì)時(shí)后的45、60、75、90、105 min取樣，并迅速更換下一個(gè)供試液小瓶和收集液小瓶，稱質(zhì)量，計(jì)算灌入和收集的供試液重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用心臟麻痹法處死大鼠，將實(shí)驗(yàn)?zāi)c段剪下，測量其長度（l）和內(nèi)徑（r）。所取樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)行測定。采用重量法［6］按下式計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀吸收系數(shù)（Papp）：

公式中：Vout和Vin分別為出腸液和入腸液體積（mL），假定出腸液與入腸液的密度均為1.0 g·cm-3，則可根據(jù)測得的入腸液和出腸液的質(zhì)量計(jì)算其體積；ν為灌流速度；l和r分別為被考察腸段的長度（cm）和橫截面半徑（cm），ρout、ρin分別為出腸處和入腸處灌流液中藥物的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專屬性：分別取pH7.4的K-R試液4 mL和酒石酸亞鐵溶液5 mL置于25 mL容量瓶中，加入pH7.5的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度。另取一個(gè)25 mL容量瓶，除不加K-R外，其余配制溶液操作同上，并以此作為空白溶液。在波長200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。掃描圖譜顯示K-R試液在500～700 nm波長范圍內(nèi)無特定吸收波長，對(duì)藥物測定無干擾。

圖1 K?R試液的紫外掃描圖Fig.1 UV spectra of Krebs?Ringer buffer

2.1.2 吸收波長的選擇：稱取干燥至恒重的茶多酚粉末適量于25 mL容量瓶中，依次加入酒石酸亞鐵溶液5 mL和pH7.4 K-R試液4 mL，充分混勻后再加入pH7.5磷酸鹽緩沖液定容至刻度。另取25 mL容量瓶，同上操作但不加茶多酚，作為空白溶液。采用紫外分光光度法進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖2。如圖所示：茶多酚在554 nm處有最大吸收，故選擇554 nm作為茶多酚含量檢測的波長。

圖2 茶多酚對(duì)照品溶液的紫外掃描圖Fig.2 UV spectra of reference substance tea polyphenol

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取干燥至恒重的茶多酚粉末50 mg至50 mL容量瓶中，加入適量pH7.4 K-R試液溶解后定容至刻度，即得濃度為1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于25 mL容量瓶中，依次加入酒石酸亞鐵溶液5 mL和K-R試液4 mL，混勻后用pH7.5磷酸鹽緩沖液定容至刻度。以儲(chǔ)備液加入量為0.0 mL的溶液作為空白，用1 cm比色杯，在554 nm波長處測定吸光度A。以A對(duì)茶多酚的濃度C（mg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝8.9375C-0.018，r2=0.9995。結(jié)果表明，當(dāng)茶多酚的濃度C在16～80 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度：配制高、中、低3個(gè)濃度的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.3”方法操作并測定吸光度，外標(biāo)法換算出相應(yīng)的濃度。每個(gè)濃度1 d內(nèi)重復(fù)測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每個(gè)濃度每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果如表1所示：該測定方法日內(nèi)、日間精密度良好，符合方法學(xué)要求。

表1 日內(nèi)、日間精密度Tab.1 Results of inter?day and intra?day precisions

表1 日內(nèi)、日間精密度Tab.1 Results of inter?day and intra?day precisions

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2.1.5 溶液穩(wěn)定性：取茶多酚供試品溶液3份，置37℃水浴中，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0 h取樣，測定吸光度，計(jì)算RSD為0.78%。結(jié)果表明，茶多酚溶液在37℃水浴條件下2.0 h內(nèi)穩(wěn)定良好，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。

2.2 影響藥物吸收的因素

2.2.1 灌流速度：Wistar大鼠15只，隨機(jī)分為3組，取濃度為0.049 7 mg·mL-1的茶多酚供試液進(jìn)行十二指腸單向灌流?？疾飚?dāng)灌流速度分別為0.3、0.6、 0.9 mL·min-1時(shí)，十二指腸對(duì)藥物吸收的影響。按“1.3.2”方法進(jìn)行操作，測定茶多酚的表觀吸收系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka，結(jié)果如表2所示：灌流速度對(duì)茶多酚的Ka和Papp影響顯著。隨著灌流速度的加快，Ka和Papp值呈線性增大。

表2 灌流速度對(duì)茶多酚吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)的影響（n= 5Tab.2 The effects of perfusion rates on Papp and Ka of tea polyphone

表2 灌流速度對(duì)茶多酚吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)的影響（n= 5Tab.2 The effects of perfusion rates on Papp and Ka of tea polyphone

1）P＜0.01 vs the group of 0.3 mL·min-1.

2.2.2 藥物濃度：Wistar大鼠15只，隨機(jī)分為3組，分別取質(zhì)量濃度為0.018 2、0.048 5和0.078 3 mg·mL-1的茶多酚供試液進(jìn)行十二指腸單向灌流，灌流速度為0.3 mL·min-1?？疾焖幬锏馁|(zhì)量濃度對(duì)藥物吸收的影響。按“1.3.2”方法進(jìn)行操作，測定茶多酚的表觀吸收系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka，結(jié)果如表3所示，茶多酚的質(zhì)量濃度對(duì)十二指腸的吸收速率常數(shù)Ka和表觀吸收系數(shù)Papp均無顯著性影響（P＞0.05）。說明茶多酚在大鼠十二指腸段的吸收不受其質(zhì)量濃度的影響，推測其藥物吸收機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散。

表3 藥物濃度對(duì)茶多酚吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)的影響（n= 5Tab.3 The effects of concentrations on Papp and Ka of tea polyphone

表3 藥物濃度對(duì)茶多酚吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)的影響（n= 5Tab.3 The effects of concentrations on Papp and Ka of tea polyphone

2.2.3 吸收部位：Wistar大鼠15只，隨機(jī)分為3組，取濃度為0.049 7 mg·mL-1的茶多酚供試液濃度，灌流速度為0.3 mL·min-1。考察不同的灌流部位（十二指腸、空腸、回腸）對(duì)藥物吸收的影響［7］。按“1.3.2”方法進(jìn)行操作，測定茶多酚的表觀吸收系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka，結(jié)果如表4所示：在相同的灌流速度下，茶多酚在大鼠小腸不同腸段的吸收速率常數(shù)Ka和表觀吸收系數(shù)Papp之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其中以空腸的吸收速率常數(shù)Ka較大，其次為十二指腸和回腸。說明茶多酚在小腸內(nèi)無特定的吸收部位。

表4 小腸吸收部位對(duì)茶多酚吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)的影響Tab.4 The effects of absorption sites on Papp and Ka of tea polyphone

表4 小腸吸收部位對(duì)茶多酚吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)的影響Tab.4 The effects of absorption sites on Papp and Ka of tea polyphone

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3 討論

本研究建立了茶多酚大鼠在體腸吸收的紫外分析方法，結(jié)果表明該方法精密度、回收率、穩(wěn)定性均良好，空白灌流液不干擾測定，符合方法學(xué)要求。本研究采用單向灌流法研究了茶多酚在大鼠小腸各腸段的吸收情況，結(jié)果顯示茶多酚在大鼠小腸不同腸段的吸收速率常數(shù)Ka和表觀吸收系數(shù)Papp之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其中空腸的吸收速率常數(shù)Ka較大，其次為十二指腸和回腸。同時(shí)隨著灌流速度的加快，Ka和Papp值呈線性增大；而茶多酚的濃度對(duì)Ka和Papp值基本無影響，故推測茶多酚在大鼠小腸吸收的主要機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散。

在體腸灌流法可以將體外與體內(nèi)相結(jié)合，并采用重量法來標(biāo)示灌流液的體積變化。在保證在體實(shí)驗(yàn)的情況下使實(shí)驗(yàn)操作更加簡便，有利于作為臨床口服藥物的評(píng)價(jià)方法。

茶多酚在大鼠小腸吸收的研究是處方前工作的重要組成部分，可以指導(dǎo)藥劑學(xué)研究人員針對(duì)藥物的吸收特點(diǎn)選擇相應(yīng)的劑型，以保證和提高制劑的生物利用度。由于茶多酚為茶葉中提取的多酚羥基類化合物，分子極性較大，水溶性較強(qiáng)而被生物膜吸收的情況較差，故推測其生物利用度較低。本研究結(jié)果證實(shí)，茶多酚在大鼠小腸各腸段的吸收情況均不理想，故制劑時(shí)應(yīng)考慮增加茶多酚的脂溶性以增強(qiáng)其在腸段的吸收。

研究中應(yīng)該注意的是為消除實(shí)驗(yàn)過程中管路對(duì)藥物吸附的影響，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)取供試液沖洗管道，沖洗至出液口藥物濃度與供試液濃度相同。

［1］劉軍海，李志洲.茶葉中有效成分應(yīng)用及其提取工藝研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（3）：173-177.

［2］唐·蘇敬.新修木草［M］.上海：上海古籍出版社，1985：116.

［3］黃海英，黃秀鑫，朱榮輝，等.茶葉保健與四季養(yǎng)生［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（6）：166-168.

［4］張曉夢(mèng)，倪艷，李先榮.茶多酚的藥理作用研究進(jìn)展［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2013，36（2）：157-160.

［5］辛然，陳彥，賈曉斌，等.枳實(shí)中黃酮成分及其提取物大鼠腸吸收特性研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（14）：1850-1854.

［6］聶淑芳，潘衛(wèi)三，李偉，等.長春西汀的大鼠在體腸吸收研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，36（10）：625-628.

［7］黃勇，唐麗，劉躍，等.野黃芩素在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國新藥雜志，2014，23（4）：457-461.

（編輯 王又冬）

Study on Absorption Kineticsof Tea Polyphenolin Rat Intestine

LIDan1，CHUYang2，YANGQian3
（1.DepartmentofPharmacy，Affiliated CentralHospitalofShenyang MedicalCollege，Shenyang 110020，China；2.DepartmentofPharmacy，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofPharmaceutics，Shenyang PharmaceuticalUniversity，Shenyang 110016；China）

ObjectiveTo investigate the absorption mechanism and absorption site oftea polyphenolin intestine.MethodsThe absorption mechanism was studied by using an in vivo intestinal rat model including duodenum，jejunum and ileum.The concentration of tea polyphenol was determined by UV-spectrophotometry，and then the absorption rate constant（Ka）and apparent absorption coefficient（Papp）was calculated，which may reflect the absorption mechanism and absorption site of tea polyphenol.ResultsPerfusion rate could significantly affect Ka and Papp（P＜0.05）；there was only little effectofdrug concentration on Ka and Papp（P＞0.05）.No significantdifference was found between Ka and Papp values of intestinal sections when at the same perfusion rate and drug concentration（P＞0.05）.ConclusionThe absorption of tea polyphenol was not affected by drug concentration.The absorption oftea polyphenolin generalintestinalsegments is poor.We should considerto improve the lipid solubility oftea polyphenolwhen making preparations fortea polyphenol.

in situ intestinal absorption；tea polyphenol；unidirectional enteroclysm；UV-Vis；rat

R969.1

A

0258-4646（2014）10-0914-04

沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（1091142-9-00）

李丹（1976-），女，副教授，碩士. E-mail：lidanjerry@126.com

2014-06-20

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：