蔣樹娟，黃丹，何蓉

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，沈陽110004）

1例有汗性外胚層發(fā)育不良患者的基因突變分析

蔣樹娟，黃丹，何蓉

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，沈陽110004）

Mutation Analysisin Patientwith Hidrotic EctodermalDysplasia：ACase Report

利用DNA測序技術(shù)對1例中國漢族有汗性外胚層發(fā)育不良患者進(jìn)行GJB6基因突變檢測，并利用生物信息學(xué)軟件對檢測到的突變進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，明確有汗性外胚層發(fā)育不良的致病原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GJB6基因c.31G＞A（p.G11R）突變是該有汗型外胚層發(fā)育不良患者的致病原因之一。

有汗型外胚層發(fā)育不良；基因突變；GJB6；DNA測序；結(jié)構(gòu)分析

有汗型外胚層發(fā)育不良（hidrotic ectodermal dysplasia，HED），又稱Clouston綜合征，人類孟德爾遺傳在線編號(hào)為129500，是一種罕見的常染色體顯性遺傳性皮膚疾病，發(fā)病率約為1/10萬。臨床主要特點(diǎn)為甲發(fā)育不良、掌跖角化、毛發(fā)稀疏或完全缺如，患者汗腺和皮脂腺功能正常，部分患者可有白內(nèi)障、斜視、骨骼改變、聽力減退、智力障礙及指（趾）畸形，臨床表現(xiàn)具有多樣性［1］。本病是由編碼連接蛋白30（connexin 30，Cx30）的GJB6基因突變所致［2］。我們利用DNA測序技術(shù)對來門診進(jìn)行遺傳咨詢的1例中國漢族有汗型外胚層發(fā)育不良患者及其父親進(jìn)行了致病基因突變分析，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患者男，28歲，自出生就發(fā)現(xiàn)頭發(fā)、指甲、趾甲發(fā)育不良。查體：無頭發(fā)，頭皮僅見少量毫毛；眉毛、睫毛、陰毛、腋毛等體毛缺如，甲板短小，指甲、趾甲發(fā)育不良、短縮、變薄，有深的縱紋（圖1A和1B），牙齒發(fā)育正常，汗腺分泌正常，視力、聽力無異常，智力發(fā)育正常，腋窩皮膚病理示表皮基本正常，真皮散在毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)，汗腺豐富（圖2A）?；颊吒赣H，50歲，臨床表現(xiàn)比患者輕，頭發(fā)、眉毛及睫毛正常，陰毛、腋毛稀少，指甲、趾甲增厚呈灰黃色（圖1C和1D），右上肢及前胸可見散在紅斑，牙齒發(fā)育正常，汗腺分泌正常，視力及聽力正常，智力發(fā)育正常，腋窩皮膚病理顯示表皮基本正常，真皮內(nèi)未見毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)，真皮下部汗腺豐富（圖2B）。

圖1 患者及其父親甲表現(xiàn)

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取：經(jīng)患者及家屬知情同意，采集患者及其父親的外周血，并獲得了他們簽署的知情同意書。采用上海華舜生物技術(shù)有限公司的外周血DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。另外以同樣的方法提取160例無親緣關(guān)系的健康對照個(gè)體基因組DNA作為對照。

1.2.2 突變檢測：GJB6含有一個(gè)外顯子，我們參照文獻(xiàn)［3］合成引物，對GJB6整個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物長度990 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含有基因組DNA 100 ng，引物0.5 μmol/L，1×PCR緩沖液，1 μmol/L dNTPs，1.5 μmol/L MgCl2，1U Taq DNA聚合酶（大連TaKaRa公司）。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min，95℃45 s，62℃45 s，72℃1 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。4 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增的目的片段純化回收后用ABI3730測序儀（美國Applied Biosystems by Life Technologies）進(jìn)行雙向測序，測序引物同前。測序結(jié)果用DNAStar 5.0和BioEdit軟件與人類基因組GJB6序列（NG_008323.1）進(jìn)行比對。

圖2 患者及其父親右腋下皮膚病理

1.2.3 Cx30結(jié)構(gòu)分析：從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）下載不同種屬的Cx30序列，利用BioEdit軟件對下載的氨基酸序列進(jìn)行比對，比較Cx30突變位點(diǎn)區(qū)域的種屬差異。瑞士生物信息學(xué)研究所創(chuàng)建的蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)包含了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）數(shù)據(jù)庫，利用該網(wǎng)站的在線預(yù)測功能，以Cx26（PDB編碼：2ZW3）為模板對野生型和突變后的Cx30進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，并進(jìn)一步利用生物信息學(xué)軟件Py-MOL（http：//www.pymol.org）對突變前后的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較［4］。

2 結(jié)果

2.1 GJB6基因突變分析

測序結(jié)果表明，患者及其父親攜帶GJB6基因雜合錯(cuò)義突變c.31G＞A（p.G11R），該突變導(dǎo)致Cx30第11位氨基酸由甘氨酸（Gly）變成精氨酸（Arg），160例無親緣關(guān)系的正常人均未見此改變（圖3）。

2.2 Cx30結(jié)構(gòu)分析

通過氨基酸序列比對可以看出Cx30的第11個(gè)氨基酸位置（p.G11）在各個(gè)種屬（如人、猩猩、狗、鼠、牛、雞）中高度保守（圖4A）。三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，突變之前甘氨酸（Gly11）可以與Cx30氨基端的組氨酸（His7）和纈氨酸（Val13）形成氫鍵，從而維持Cx30正常的三級(jí)結(jié)構(gòu)；突變成精氨酸（Arg11）之后，增加的側(cè)鏈還可以與氨基端的蘇氨酸（Thr8）和第一跨膜區(qū)的蘇氨酸（Thr26）形成氫鍵（圖4B、C），這可能會(huì)影響Cx30的正常折疊，從而影響其正常的空間構(gòu)象。另外，突變?yōu)榫彼嶂驝x30氨基末端的局部區(qū)域還增加了正電荷，這可能會(huì)對Cx30正常結(jié)構(gòu)的形成產(chǎn)生影響，或?qū)π纬傻倪B接蛋白通道的通透性產(chǎn)生影響。

圖3 GJB6基因測序圖

3 討論

有汗型外胚層發(fā)育不良是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，多見于法籍加拿大人。1996年Kibar等［5］利用基因連鎖分析確定了HED2的染色體定位，2000年Lamartine等［6］進(jìn)一步證實(shí)GJB6基因突變是該綜合征的致病原因。迄今為止，在HED患者中已發(fā)現(xiàn)該基因的4種突變：（1）大多數(shù)HED患者發(fā)病的原因是c.31G＞A（p.G11R）突變，該突變導(dǎo)致Cx30的氨基末端引入了一個(gè)正電荷的精氨酸。Lamartine等［6］研究了來自不同地理區(qū)域（蘇格蘭、非洲、西班牙、法裔加拿大人、法國、印度、馬來群島及威爾士）的12個(gè)患病家系，發(fā)現(xiàn)除了印度、馬來群島和威爾士的患者攜帶c.263C＞T突變外，幾乎所有的患者為c.31G＞A突變，這一突變還在黎巴嫩和德國患者中被發(fā)現(xiàn)［7］，中國也相繼在5個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變［8～12］，本研究也在先證者和其父親中檢測到c.31G＞A（p.G11R）突變的存在，進(jìn)一步支持此突變是導(dǎo)致HED發(fā)病的主要原因。（2）錯(cuò)義突變c.263C＞T（p.A88V）［2］，該突變在Cx30的第2個(gè)跨膜區(qū)引入了1個(gè)高疏水性的氨基酸殘基。李汶等［13］也在一中國家系中發(fā)現(xiàn)此突變，并在基因診斷基礎(chǔ)上對該家系中一孕婦孕5個(gè)多月的胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。（3）第3種突變c.110T＞A（p.V37E），該突變是Smith等［14］在研究一個(gè)散發(fā)的來自蘇格蘭的病例時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它直接導(dǎo)致了Cx30第1個(gè)跨膜區(qū)域的氨基酸的改變，引入了一個(gè)帶負(fù)電荷的谷氨酸。（4）第4種突變c.148G＞A（p.D50N），該突變發(fā)生在Cx30的第一個(gè)胞外區(qū)，是Baris等［15］在患有HED的北歐猶太人中發(fā)現(xiàn)的，后兩種突變尚未在中國患者中發(fā)現(xiàn)。

圖4 Cx30氨基末端氨基酸序列比對及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

GJB6基因編碼Cx30蛋白，屬于縫隙連接蛋白基因家族，與相鄰細(xì)胞膜上的半通道或稱連接子組成一個(gè)完整的縫隙連接通道，使相鄰細(xì)胞間離子、代謝物質(zhì)和小的信使分子直接轉(zhuǎn)運(yùn)，對細(xì)胞增殖、分化及機(jī)體的生長發(fā)育具有意義［16］。據(jù)報(bào)道，Cx30在特定的組織優(yōu)先表達(dá)，在小鼠中，Cx30在成鼠的大腦和皮膚中高度表達(dá)［17］。Fujimoto等［7］利用免疫染色的方法證明Cx30在毛囊、表皮和指甲中高度表達(dá)，并證明其在表皮細(xì)胞的分化、毛囊和指甲的生長過程中起到了重要的作用，由此推測突變的Cx30可能影響這些組織的增殖和分化，從而導(dǎo)致HED的發(fā)生。連接蛋白結(jié)構(gòu)上具有相似性，每種連接蛋白都具有4個(gè)跨膜區(qū)，2個(gè)胞外區(qū)，3個(gè)胞內(nèi)區(qū)，人類Cx30編碼261個(gè)氨基酸，與Cx26具有77%的同源性［18］。本研究在患者中檢測到的突變發(fā)生在Cx30的氨基末端，為了進(jìn)一步明確此突變的致病機(jī)制，我們對不同種屬的氨基酸序列進(jìn)行了比對，并對突變前后Cx30的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，通過氨基酸序列比對可以看出Cx30的第11個(gè)氨基酸位置（p. G11）在人、猩猩、狗、鼠、牛、雞各個(gè)種屬中高度保守。甘氨酸是只含有2個(gè)碳原子的脂肪族氨基酸，當(dāng)甘氨酸被含有6個(gè)碳原子帶有正電荷的精氨酸取代后，不僅增加了側(cè)鏈的長度，還引入了能提供正電荷的氨基，三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，突變之前甘氨酸（Gly11）可以與Cx30氨基端的組氨酸（His7）和纈氨酸（Val13）形成氫鍵，從而維持Cx30正常的三級(jí)結(jié)構(gòu)；突變成精氨酸（Arg11）之后，增加的側(cè)鏈還可以與氨基端的蘇氨酸（Thr8）和第一跨膜區(qū)的蘇氨酸（Thr26）形成氫鍵，這可能會(huì)影響Cx30的正常折疊，從而影響其正常的空間構(gòu)象。另外，突變?yōu)榫彼嶂驝x30氨基末端的局部區(qū)域還增加了正電荷，這可能會(huì)對Cx30正常結(jié)構(gòu)的形成產(chǎn)生影響，或?qū)π纬傻倪B接蛋白通道的通透性產(chǎn)生影響。

有汗型外胚層發(fā)育不良的臨床表現(xiàn)具有多樣性，本研究中患者主要表現(xiàn)為甲和毛發(fā)的異常，不伴有掌跖角化?；颊吆推涓赣H的表現(xiàn)不盡相同，患者指、趾甲表現(xiàn)為甲板短小，甲發(fā)育不良、短縮、變薄，有深的縱紋，而其父親則表現(xiàn)為指、趾甲增厚、呈灰黃色；患者毛發(fā)損害較重，頭發(fā)及各種體毛均缺如，而其父親毛發(fā)損害較輕，除陰毛、腋毛稀少外頭發(fā)、眉毛及睫毛等均正常。同為c.31G＞A（p.G11R）突變導(dǎo)致的HED，文獻(xiàn)［8，10，12］報(bào)道的家系中患者有典型的三大癥狀（甲發(fā)育不良、掌跖角化、毛發(fā)稀疏或完全缺如）；陳楠［9］、劉寧等［11］報(bào)道的家系與本研究患者的表現(xiàn)相同，除了甲和毛發(fā)異常外，不伴有掌跖角化；除此之外此突變還可伴有杵狀指和或智力低下等［8，9］。同一突變在相同種族人群中導(dǎo)致的表型差異可能與基因突變的外顯度不同相關(guān)，或與某些未知的調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)，也可能與環(huán)境因素相關(guān)。

HED臨床表現(xiàn)的多樣性和個(gè)體差異對臨床診斷造成困難，利用GJB6基因突變檢測方法對HED患者進(jìn)行檢測能夠明確病因，從而更好地為患者提供遺傳咨詢。對Cx30蛋白結(jié)構(gòu)的分析能使我們更好地理解HED的致病機(jī)制。

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（編輯 陳姜）

R394.3

A

0258-4646（2014）10-0941-04

蔣樹娟（1985-），女，博士研究生.

何蓉，E-mail：her@sj-hospital.org

2013-06-01

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