李昭，白英龍，姜紅堃，趙衛(wèi)華，田文，程穎，宋立新，孫英賢，胡健

（中國醫(yī)科大學1.附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科；2.公共衛(wèi)生學院兒少衛(wèi)生學教研室；3.附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽110001）

生長激素釋放肽Ghrelin改善自發(fā)性糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷

李昭1，白英龍2，姜紅堃3，趙衛(wèi)華1，田文1，程穎1，宋立新1，孫英賢1，胡健1

（中國醫(yī)科大學1.附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科；2.公共衛(wèi)生學院兒少衛(wèi)生學教研室；3.附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽110001）

目的明確外源性生長激素釋放肽Ghrelin對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷的影響，探討其可能的內(nèi)皮保護機制。方法大鼠編號隨機分為3組：Wistar組（正常對照組），Wistar大鼠8只，蒸餾水灌胃4周；GK組（對照組），GK大鼠8只，同等容量蒸餾水灌胃4周；Ghrelin組（實驗組），GK大鼠8只，外源性Ghrelin腹腔注射4周。留取大鼠動脈血液，采集血清和血管組織標本，檢測血清內(nèi)皮素1（ET-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，計算胰島素抵抗指數(shù)；采用免疫組化方法測量TNF-α蛋白表達。結果實驗4周后，與Wistar組大鼠比較，GK組大鼠血清ET-1、TNF-α水平升高（P＜0.05）；Ghrelin組血清ET-1、TNF-α水平較GK組降低（P＜0.05）；Ghrelin組大鼠的胰島素抵抗指數(shù)低于GK組（P＜0.05）。主動脈血管組織HE染色提示Ghrelin組大鼠血管內(nèi)皮結構接近Wistar組；免疫組化結果顯示Ghrelin干預后大鼠血管TNF-α表達量較GK組低（P＜0.05）。結論Ghrelin腹腔注射可減輕自發(fā)性糖尿病大鼠胰島素抵抗，改善自發(fā)性糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷，其機制可能與較長期Ghrelin在體干預降低TNF-α血清水平及組織表達有關。

生長激素釋放肽；胰島素抵抗；腫瘤壞死因子α；內(nèi)皮損傷

糖尿病血管病變是危害最大的一種慢性并發(fā)癥，包括心臟的大血管、微血管以及周圍血管病變，其發(fā)病機制有多種因素通過多種途徑參與，其中內(nèi)皮功能障礙是引起動脈粥樣硬化的早期關鍵事件［1］，也是糖尿病血管病變的病理生理基礎，改善或延緩內(nèi)皮功能障礙是防治糖尿病血管并發(fā)癥的重要途徑。

小分子肽Ghrelin是1999年由Kojima等［2］從大鼠胃黏膜細胞分離純化得到的一種由28個氨基酸組成的內(nèi)源性促生長激素釋放肽，隨著其生物學作用領域的拓展及研究的深入，學者們發(fā)現(xiàn)其可促進血管新生、抑制炎癥和血管內(nèi)皮細胞凋亡［3～6］。新近有研究報道血漿Ghrelin濃度與患者頸動脈中膜厚度呈負相關，推測Ghrelin很可能可以降低動脈粥樣硬化的發(fā)生率［7］。因此Ghrelin的血管保護效應受到越來越多的關注，但其確切的保護效應及作用機制尚有待探求。本研究應用外源性的Ghrelin注射于大鼠腹腔，采用免疫組織化學技術、放射免疫技術觀察其對大鼠血管內(nèi)皮及相關因子的影響，探討Ghrelin確切的血管保護效應及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級12周齡雄性自發(fā)性糖尿病大鼠（Goto-Kakisaki Wistar大鼠，簡稱GK大鼠）16只和SPF級12周齡雄性Wistar大鼠8只，購于上海斯萊科實驗動物有限責任公司，合格證號為SCXK（滬）2003-0003。所有大鼠均在中國醫(yī)科大學實驗動物部SPF級飼養(yǎng)室分籠飼養(yǎng)大鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下，自由進食飲水，室溫控制在18～20℃，濕度60%～70%。隨機分組干預4周后取血采集血清，并采集心肌、血管標本。外源性Ghrelin購于上海Sirocco Pharmaceutic公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組：大鼠編號，隨機分為3組：Wistar組（正常對照組），12周齡雄性Wistar大鼠8只，蒸餾水灌胃4周；GK組（對照組），SPF級12周齡GK大鼠8只，同等容量蒸餾水灌胃4周；Ghrelin組（實驗組），SPF級12周齡GK大鼠8只，外源性Ghrelin 200 μg·kg-1·d-1腹腔注射4周。

1.2.2 空腹血糖、血清內(nèi)皮素1（endothelin 1，ET-1）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測：應用葡萄糖氧化酶法進行空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）測定，空腹胰島素（fasting plasma insulin，F(xiàn)INS）測定采用放射免疫法，參考文獻［8］計算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；血清ET-1和血漿TNF-α測定采用放射免疫法，參照說明書。

1.2.3 HE染色及免疫組織化學方法：主動脈組織HE染色參考文獻［9］。免疫組化法測定TNF-α按照說明書進行，以PBS代替一抗為陰性對照，以細胞質(zhì)中有棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞［10，11］。應用顯微圖像分析系統(tǒng)（中國醫(yī)科大學實驗設備處提供）對選取視野內(nèi)免疫組化陽性信號進行光強度及面積分析，計算各組TNF-α光密度值，灰度積分值與染色面積和強度成反比，表達越強灰度積分值越低。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠主動脈組織HE染色

大鼠主動脈HE染色提示W(wǎng)istar組（圖1A）大鼠主動脈內(nèi)膜較光滑；GK組大鼠（圖1B）主動脈有散在內(nèi)皮細胞腫脹、脫落，膠原纖維增生，局部內(nèi)彈力板水腫、厚薄不均或分層；Ghrelin組（圖1C）可見主動脈內(nèi)膜較光滑，血管平滑肌細胞呈平行排列，細胞核大小均一，內(nèi)彈力板無水腫。

圖1 大鼠主動脈HE染色×400Fig.1 HE staining of the aorta×400

2.2 各組大鼠內(nèi)皮損傷相關指標的比較

GK組大鼠的HOMA-IR、ET-1、TNF-α明顯高于Wistar組和Ghrelin組（P＜0.05）；Ghrelin組的上述指標均明顯低于GK組（P＜0.05），但與Wistar組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠主動脈TNF-α免疫組化染色

GK組大鼠主動脈TNF-α表達水平高于Wistar組（P＜0.05）；Ghrelin組大鼠的主動脈TNF-α表達水平低于GK組（P＜00.05）；Wistar組大鼠的主動脈TNF-α表達水平低于Ghrelin組，但二者比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1 3組大鼠HOMA?IR和血清ET?1及TNF?α水平比較Tab.1 Comparison of HOMA?IR，ET?1 and TNF?α levels

圖2 主動脈組織TNF?α免疫組化染色×200Fig.2 Immunohistochemical staining of TNF?α in aorta×200

3 討論

胰島素抵抗的存在及大量炎性因子的生成是促進血管內(nèi)皮功能不全的重要因素［12］。作為生長激素釋放激素的內(nèi)源性配體，Ghrelin的生物化學、生理及病理生理學、臨床藥理學等方面的研究日益增多并取得了較大進展。臨床研究顯示，低Ghrelin水平與胰島素抵抗、高血壓以及2型糖尿病相關［13］。分子水平的研究證明Ghrelin基因多態(tài)性與葡萄糖耐量受損個體發(fā)生2型糖尿病的危險性相關［14］。研究報道Ghrelin基因編碼區(qū)的變異與肥胖和2型糖尿病有相關性［15］。本研究應用Ghrelin腹腔注射的GK大鼠HOMA-IR較未應用Ghrelin腹腔注射的GK大鼠下降，證實外源性Ghrelin可以改善GK大鼠的胰島素抵抗。

實驗中伴有嚴重胰島素抵抗的GK大鼠在應用外源性Ghrelin后內(nèi)皮結構得到顯著改善，并且血清ET-1水平得以降低。ET-1是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，其引起的血管收縮、心肌缺血、代謝紊亂和細胞增殖是血管疾病的關鍵致病因素［16～18］。腹腔注射外源性Ghrelin，使GK大鼠血清ET-1水平下降，證實Ghrelin可以改善GK大鼠的內(nèi)皮功能障礙。我們從血管內(nèi)皮損傷的發(fā)病機制最重要的環(huán)節(jié)——炎性反應學說探求其中可能的機制。TNF-α是炎性因子網(wǎng)絡中的關鍵成分，過量的TNF-α作為炎性介質(zhì)可直接或間接損傷血管內(nèi)皮［19］。近年來研究機體胰島素抵抗的發(fā)生與TNF-α含量升高密切相關［20］；TNF-α可引起葡萄糖轉運蛋白4信使RNA膜兩側分布下降，又可抑制葡萄糖轉運蛋白4的跨膜轉運［21］，從而造成胰島素介導的糖攝入下降，引起胰島素抵抗。研究報道TNF-α可誘導內(nèi)皮細胞合成釋放ET-1，同時加速內(nèi)皮型一氧化氮合酶信使RNA的降解，減弱基因啟子的活性從而下調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達［22］，進而誘發(fā)內(nèi)皮損傷及功能障礙。

本實驗選用的GK大鼠是通過對Wistar大鼠進行口服葡萄糖耐量試驗并篩選高血糖的個體進行培育而成。實驗結果證實，GK組大鼠FINS和HOMA-IR明顯升高，存在明確的血管內(nèi)皮損傷改變，應用Ghrelin后GK大鼠血清放射免疫檢測以及免疫組化結果提示TNF-α水平表達下降。我們推測，Ghrelin可能通過降低TNF-α水平，改善胰島素抵抗以及調(diào)節(jié)ET-1表達，從而改善GK大鼠的血管內(nèi)皮功能障礙，但具體傳導信號通道尚需進一步探求。

參考文獻：

［1］Hadi HA，Suwaidi JA.Endothelial dysfunction in diabetes mellitus［J］.Vasc Health Risk Manag，2007，3（6）：853-876.

［2］Kojima M，Hosoda H，Date Y，et al.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach［J］.Nature，1999，402（6762）：656-660.

［3］Warzecha Z，Ceranowicz D，Dembiński A，et al.Ghrelin accelerates the healing of cysteamine-induced duodenal ulcers in rats［J］.Med Sci Monit，2012，18（5）：BR181-BR187.

［4］Cao Y，Tang J，Yang T，et al.Cardioprotective effect of ghrelin in cardiopulmonary bypass involves a reduction in inflammatory response［J］.PLoS One，2013，8（1）：e55021.

［5］Deboer MD，Zhu X，Levasseur PR，et al.Ghrelin treatment of chronic kidney disease：improvements in lean body mass and cytokine profile［J］.Endocrinology，2008，149（2）：827-835.

［6］Zhang G，Yin X，Qi Y，et al.Ghrelin and cardiovascular diseases［J］.Curr Cardiol Rev，2010，6（1）：62-70.

［7］Hajmohammadi T，Sadeghi M，Dashti M，et al.Relationship between carotid intima-media thickness with some inflammatory biomarkers，ghrelin and adiponectin in iranians with and without metabolic syndrome in Isfahan cohort study［J］.ARYA Atheroscler，2010，6（2）：56-61.

［8］Qi Q，Bray GA，Hu FB，et al.Weight-loss diets modify glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor rs2287019 genotype effects on changes in body weight，fasting glucose，and insulin resistance：the Preventing Overweight Using Novel Dietary Strategies trial［J］.Am J Clin Nutr，2012，95（2）：506-513.

［9］趙悅，王雪蓮，劉沛.內(nèi)毒素休克大鼠胸主動脈平滑肌細胞超微結構改變［J］.中國醫(yī)科大學學報，2006，35（1）：9-10.

［10］夏麗萍，方芳，魯靜，等.腫瘤壞死因子樣凋亡的微弱誘導劑在類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的表達［J］.細胞與分子免疫學雜志，2010，26（6）：5-67.

［11］曹陽張，玉強，王巖峰，等.Akt/PKB對大鼠脊髓損傷后TNF-α表達的影響［J］.中國矯形外科雜志，2010，39（22）：7-60.

［12］Jheng HF，Tsai PJ，Guo SM，et al.Mitochondrial fission contributes to mitochondrial dysfunction and insulin resistance in skeletal muscle［J］.Mol Cell Biol，2012，32（2）：309-319.

［13］Yagi T，Ueda H，Amitani H，et al.The role of ghrelin，salivary secretions，and dental care in eating disorders［J］.Nutrients，2012，4（8）：967-989.

［14］Mager U，Degenhardt T，Pulkkinen L，et al.Variations in the ghrelin receptor gene associate with obesity and glucose metabolism in individuals with impaired glucose tolerance［J］.PLoS One，2008，3（8）：e2941.

［15］Reslan OM，Khalil RA.Vascular effects of estrogenic menopausal hormone therapy［J］.Rev Recent Clin Trials，2012，7（1）：47-70.

［16］Khalil RA.Modulators of the vascular endothelin receptor in blood pressure regulation and hypertension［J］.Curr Mol Pharmacol，2011，4（3）：176-186.

［17］Harrison-Bernard LM，de Garavilla L，Bivona BJ.Enhanced vascular chymase-dependent conversion of endothelin in the diabetic kidney［J］.Ochsner J，2013，13（1）：49-55.

［18］Meens MJ，Compeer MG，Hackeng TM，et al.Stimuli of sensorymotor nerves terminate arterial contractile effects of endothelin-1 by CGRP and dissociation of ET-1/ETA-receptor complexes［J］. PLoS One，2010，5（6）：e10917.

［19］Carneiro FS，Webb RC，Tostes RC.Emerging role for TNF-α in erectile dysfunction［J］.J Sex Med，2010，7（12）：3823-3834.

［20］Leguisamo NM，Lehnen AM，Machado UF，et al.GLUT4 content decreases along with insulin resistance and high levels of inflammatory markers in rats with metabolic syndrome［J］.Cardiovasc Diabetol，2012，11：100.

［21］Pina-Canseco Mdel S，Páez-Arenas A，Massó F，et al.Protein C activation peptide inhibits the expression of ICAM-1，VCAM-1，and interleukin-8 induced by TNF-α in human dermal microvascular endothelial cells［J］.Folia Histochem Cytobiol，2012，50（3）：407-413.

（編輯 陳姜）

Ghrelin Improve Spontaneous Vascular EndothelialInjury in Goto-KakisakiWistar Rats

LI Zhao1，BAI Ying-long2，JIANG Hong-kun3，ZHAO Wei-hua1，TIAN Wen1，CHENG Ying1，SONG Li-xin1，SUN Yingxian1，HUJian1
（1.Department of Cardiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Child and Adolescent，School of Public Health，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofPediatrics，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study whether exogenous growth hormone releasing peptide Ghrelin can improve diabetes vascular endothelial injury in rats，and explore its possible mechanism.MethodsRats were randomly divided into 3 groups：Wistar groups：4-week gavage with distilled water；GK group：4-week gavage with distilled water；Ghrelin group：intraperitoneal injection of exogenous Ghrelin in 4 weeks.The rats serum endothelin 1（ET-1），tumornecrosis factorα（TNF-α）levels，and insulin resistance index were determined.TNF-αprotein expression are measured by immunohistochemical method.ResultsAfter 4 weeks，serum ET-1 and TNF-α levels in GK group was higher than in Wistar group（P＜0.05）.ET-1 and TNF-α levels from Ghrelin group was reduced compared with GK group（P＜0.05）.HOMA index of Ghrelin group was lower than that of GK group（P＜0.05）.Vascular endothelial structure of Ghrelin group was close to Wistar group.Immunohistochemical results showed that the expression of TNF-αin Ghrelin group was lowerthan GKgroup（P＜0.05）.ConclusionIntraperitonealinjection ofGhrelin can reduce spontaneous diabetes rats with insulin resistance，and improves endothelial damage in spontaneous diabetes rats，the mechanism may be related to the longer-term Ghrelin intervention in reducing TNF-α.

growth hormone releasing peptide；insulin resistance；tumor necrosis factor α；endothelial damage

R543.5

A

0258-4646（2014）10-0902-04

高等學校博士學科點專項科研基金（20112104120002）

李昭（1975-），女，講師，博士.

胡健，E-mail：meilichian@aliyun.com

2014-07-17

網(wǎng)絡出版時間：