宮琦玉，汲坤，張麗艷，王波，楚琪，張明璇

（1.牙克石市人民醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽醫(yī)學院病理生理學教研室，沈陽110034；3.內(nèi)蒙古民族大學第二臨床醫(yī)學院病理科，內(nèi)蒙古民族大學分子病理學研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；4.沈陽醫(yī)學院2012級臨床醫(yī)學，沈陽110034）

RNA干擾抑制乳腺癌MCF?7細胞鼠雙微體?2基因表達及細胞增殖的實驗研究

宮琦玉1，汲坤2，張麗艷2，王波3，楚琪4，張明璇4

（1.牙克石市人民醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽醫(yī)學院病理生理學教研室，沈陽110034；3.內(nèi)蒙古民族大學第二臨床醫(yī)學院病理科，內(nèi)蒙古民族大學分子病理學研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；4.沈陽醫(yī)學院2012級臨床醫(yī)學，沈陽110034）

目的研究乳腺增生癥、乳腺導管內(nèi)癌和浸潤性乳腺癌組織中mdm2蛋白的表達及siRNA mdm2對腫瘤細胞增殖的影響。方法采用免疫組織化學方法檢測乳腺增生癥、乳腺導管內(nèi)癌和浸潤性乳腺癌組織中mdm2蛋白的表達；將siRNA mdm2質(zhì)粒轉染乳腺癌MCF-7細胞，應用MTT檢測siRNA mdm2對腫瘤細胞增殖的抑制作用。結果mdm2蛋白在乳腺導管內(nèi)癌組織和浸潤性乳腺癌組織中的陽性表達率均為100%（18/18，20/20），在乳腺增生癥組織中表達陽性率為20%（4/20）。與乳腺增生癥組織比較，乳腺導管內(nèi)癌組織和浸潤性乳腺癌組織中mdm2蛋白陽性表達率明顯增高（P＜0.01）。MTT結果表明轉染pGCsiRNA-mdm2后MCF-7細胞生長受到抑制，與mock組和pGCsiRNA-scramble組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。轉染pGCsiRNA-mdm2 72 h后與48 h比較，MCF-7細胞生長受抑制明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論mdm2在乳腺癌組織中存在廣泛表達，其陽性表達可能促進腫瘤細胞的增殖過程。

乳腺增生癥；乳腺導管內(nèi)癌；浸潤性乳腺癌；鼠雙微體-2；RNA干擾

隨著細胞生物學和分子生物學理論和技術的飛速發(fā)展，基因治療特別是腫瘤的基因治療已成為備受矚目的研究領域。現(xiàn)已證明腫瘤的發(fā)生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相關基因的改變導致細胞增殖分化和凋亡失調(diào)的結果。近年來研究認為鼠雙微體-2基因（murine double minute-2，mdm2）高度表達與腫瘤形成有關［1，2］，已證實mdm2基因是一種癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生、增殖及侵襲有關［3］，這些特性有可能使它成為腫瘤基因治療的新靶點。本實驗應用RNA干擾（RNAi）技術沉默乳腺癌MCF-7細胞中癌基因mdm2的表達，從mRNA和蛋白水平觀察siRNA mdm2對乳腺癌MCF-7細胞中mdm2表達的影響，為進一步深入研究mdm2相關基因p53及其信號轉導通路在乳腺癌發(fā)病中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

組織標本資料：20例乳腺增生癥石蠟標本，18例乳腺導管內(nèi)癌石蠟標本和20例浸潤性乳腺癌石蠟標本。其中男性1例，女性57例，年齡27～78歲，平均年齡54歲，為2012年1月至2014年4月內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院收治的患者組織標本，組織切片均經(jīng)病理學證實。

細胞株與主要試劑：乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自美國Hyclone公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自美國Promega公司，TaqDNA聚合酶購自日本TaKaRa公司，瓊脂糖、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N－二甲基雙丙烯酰胺、DTT、β-巰基乙醇、PMSF購自美國Sigma公司，蛋白抽提試劑盒購自中國BOGOO公司，兔抗人mdm2抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗和DAB顯色劑購自美國Santa Cruz公司，引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色：組織標本常規(guī)10%甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)浸蠟，包埋，切片至水后行免疫組織化學染色。顯微鏡下觀察組織標本細胞核中mdm2的表達情況，根據(jù)細胞核內(nèi)棕染顆粒多少和染色的強弱，將表達強度分為不表達（-）和陽性表達（+）。判定方法如下：每張切片隨機選取10個高倍視野。按著色細胞百分數(shù)計分：0分＜10%；1分10%～25%；2分＞25%～75%；3分＞75%。0分為陰性（-）；1分以上記為陽性（+）。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：乳腺癌MCF-7細胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，5%的CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。待細胞生長達到80%融合時，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，傳代，更換新鮮的含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，傳代比率為1∶2或1∶3。

1.2.3 重組質(zhì)粒的轉染：pGCSilencer neo2.0-U6/GFP-mdm2 siRNA質(zhì)粒（以下簡稱pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒）和陰性對照質(zhì)粒pGCsiRNA-scramble（由本課題組構建）。mdm2-siRNA的DNA模板：正義鏈5′-GATCCGACACTTATACTATGAAAGTTCAAGAGACTTTCAT AGTATAAGTGTCTTTTTTGGAAA-3′；反義鏈：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGACACTTATACTATGAAAGT CTCTTGAACTTTCATAGTATAAGTGTCG-3′。按照質(zhì)粒抽提試劑盒操作說明提取pGCsiRNA-mdm2和pGCsiRNA-scramble重組質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000轉染試劑將上述質(zhì)粒轉染MCF-7細胞，于轉染后72 h收集細胞。按照RNA提取試劑盒和蛋白抽提試劑盒提取總RNA和蛋白質(zhì)，待做RT-PCR和Western blot分析。

1.2.4 MTT比色法檢測細胞活力：取對數(shù)生長期MCF-7細胞接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度為5×104/mL，每孔180 μL，每組設6復孔，設48 h、72 h兩個時間點。各組分別為mock組、pGCsiRNA-scramble組及pGCsiRNA-mdm2組。細胞培養(yǎng)至第44 h和68 h，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩10 min，酶標儀檢測波長570 nm時各孔的吸光度值，計算細胞的生長存活率。實驗重復3次。細胞存活率（%）=實驗組光密度值/對照組光密度值×100。

1.2.5 RT-PCR檢測MCF-7細胞中mdm2mRNA的表達：取上述提取的總RNA，按逆轉錄試劑盒操作步驟將總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用mdm2及GAPDH的引物進行PCR擴增，30個循環(huán)后取PCR產(chǎn)物進行電泳，采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析，以mdm2與GAPDH光密度比值確定其含量，實驗重復3次。mdm2引物序列如下，擴增片段364 bp：正義鏈：5′-GAAAGCCAAACTGG AAAACTCA-3′；反義鏈：5′-ACATGTAAAGCAGGCC ATAAGA-3′。GAPDH引物序列如下，擴增片段617 bp：正義鏈5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTAT GT-3′；反義鏈5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTG AAGTC-3′。

1.2.6 Western blot檢測MCF-7細胞中mdm2蛋白的表達：取上述提取的總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量。取50 μg蛋白樣品置于100℃沸水中熱變性5 min，用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離電泳。分離的蛋白質(zhì)用電轉移轉至硝酸纖維素膜上，與mdm2抗體孵育，加入堿性磷酸酶標記的二抗，顯色液顯色，拍照。特異性條帶的信號采用GIS凝膠成像分析系統(tǒng)處理，以mdm2與actin光密度比值確定其含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，各組數(shù)據(jù)用表示，2組間差異顯著性分析用兩樣本均數(shù)差別t檢驗；乳腺導管內(nèi)癌和浸潤性乳腺癌組織與乳腺增生癥組織mdm2表達比較采用Fisher Exact檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 mdm2蛋白在乳腺增生癥、乳腺導管內(nèi)癌和浸潤性乳腺癌組織中的表達

通過對乳腺組織免疫組織化學染色結果分析，發(fā)現(xiàn)mdm2蛋白表達于細胞核中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。mdm2蛋白在20例乳腺增生癥組織中表達陽性率為20%（4/20），在18例乳腺導管內(nèi)癌組織中均呈陽性表達，陽性表達率為100%（18/18），在20例浸潤性乳腺癌組織中均呈陽性表達，陽性表達率為100%（20/20），見圖1。乳腺導管內(nèi)癌組織和浸潤性乳腺癌組織與乳腺增生癥組織mdm2陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

圖1 乳腺增生癥、乳腺導管內(nèi)癌和浸潤性乳腺癌組織中mdm2的表達Fig.1 Immunohistochemical analysis of mdm2 expression in cyclomastopathy tissues，ductal carcinoma in situ tissues and invasive breast cancer tissues

表1 mdm2在乳腺增生癥組織，乳腺導管內(nèi)癌組織和浸潤性乳腺癌組織中的表達Tab.1 Expression of mdm2 in cyclomastopathy tissues，ductal carcinoma in situ tissues and invasive breast cancer tissues

2.2 MTT檢測pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒對MCF-7細胞增殖能力的影響

MTT比色法檢測pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒轉染48 h和72 h后各組細胞的增殖能力，以mock組的生存率作為100%。結果顯示：轉染48 h和72 h，與mock和pGCsiRNA-scramble組比較，pGCsiRNA-mdm2組抑制了MCF-7細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。48 h和72 h pGCsiRNA-mdm2組細胞存活率分別為62.4%和48.6%，pGCsiRNA-mdm2轉染72 h抑制細胞增殖效果優(yōu)于48 h，見圖2。

圖2 MTT法檢測pGCsiRNA?mdm2對MCF?7細胞增殖的影響Fig.2 Survival rate of MCF?7 cells after treatment of pGCsiRNA?mdm2 plasmid

2.3 pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒對MCF-7細胞mdm2mRNA表達的影響

與mock組和pGCsiRNA-scramble組比較，pGC-siRNA-mdm2組mdm2mRNA表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒對MCF-7細胞mdm2蛋白表達的影響

與mock組和pGCsiRNA-scramble組比較，pGC-siRNA-mdm2組mdm2蛋白表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖3 pGCsiRNA?mdm2質(zhì)粒作用下MCF?7細胞中mdm2 mRNA的表達水平Fig.3 Expression of mdm2 mRNA in MCF?7 cells transfected with plasmid

圖4 pGCsiRNA?mdm2質(zhì)粒作用下MCF?7細胞中mdm2蛋白的表達水平Fig.4 Expression of mdm2 protein in MCF?7 cells transfected with plasmid

3 討論

乳腺癌已經(jīng)成為危害女性健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的30%，居首位；其死亡率占女性惡性腫瘤15%，居第二位［4］。早期診斷、手術后放療、化療和內(nèi)分泌治療等綜合手段的應用，使乳腺癌病死率呈下降趨勢。但乳腺癌的復發(fā)轉移，尤其是遠處轉移仍然是最大的難題，因此尋找新的治療策略降低乳腺癌的復發(fā)和轉移是迫切需要解決的問題。近年來隨著對腫瘤細胞生長、增殖、凋亡的分子機制研究的深入，腫瘤的治療已進入生物治療時代，主要針對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關的癌基因及其相關表達產(chǎn)物進行治療。

癌基因mdm2最初由Donna George及其合作者在自發(fā)腫瘤鼠Balb/c3T3成纖維細胞系（3T3DM）中鑒定出來，它在進化過程中很保守，在鼠和人的許多組織中都有表達。1992年Oliner等以小鼠mdm2 cDNA為探針克隆了人mdm2基因。mdm2蛋白的相對分子質(zhì)量為90 kD，是定位于細胞核中的一種高度酸性蛋白質(zhì)。mdm2基因作為p53的轉錄靶基因可因wt-p53誘導而轉錄增強，其表達產(chǎn)物mdm2蛋白又轉而與p53蛋白形成復合物，抑制其介導的轉錄活性，并將p53蛋白轉運到細胞質(zhì)中降解。同時可以穩(wěn)定突變型p53蛋白的作用，從而阻斷p53的細胞生長抑制作用。二者形成p53/mdm2負反饋調(diào)節(jié)環(huán)，使細胞內(nèi)的p53/mdm2比率保持恒定，以保證細胞正常生長。mdm2還可以通過抑制Rb活性直接發(fā)揮抑制抑癌基因的作用，還可與Rb相關的E2F-1蛋白結合，加快細胞的分裂與增殖。此外，mdm2本身具有DNA結合能力，可直接作用于靶DNA，促進DNA的合成和細胞的生長，以拮抗P53的效應，即具有不依賴于P53而促進腫瘤生長的作用［5］。國內(nèi)外學者用免疫組織化學方法對不同腫瘤組織中mdm2蛋白表達情況進行的研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌［6］、食管癌［7］、胃癌［8］、宮頸癌［9］、喉癌［10］、結直腸癌［11］等腫瘤組織中都有mdm2的過量表達。本研究中人乳腺組織免疫組織化學染色顯示mdm2蛋白在乳腺增生癥組織中表達陽性率為20%，在乳腺導管內(nèi)癌和浸潤性乳腺癌組織中陽性表達率均為100%。

RNAi是1998年由Fire等提出的，近年快速發(fā)展的一種基因沉默技術，具有高度特異性、作用效率高和干擾作用可擴散的特點，具有很強的抑制目的基因的作用。使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。本課題組將成功構建的mdm2RNA干擾質(zhì)粒轉染乳腺癌MCF-7細胞，在細胞增殖能力實驗中，pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒組細胞增殖能力與mock組和pGCsiRNA-scramble組比較明顯下調(diào)。在mdm2mRNA和蛋白表達實驗中pGCsiRNA-mdm2質(zhì)粒組mdm2表達水平明顯低于mock組和pGCsiRNA-scramble組。

本研究表明乳腺癌組織中mdm2蛋白表達成陽性，mdm2RNA干擾質(zhì)粒能下調(diào)乳腺癌MCF-7細胞中mdm2mRNA和蛋白的表達，并抑制乳腺癌細胞的增殖活性，對乳腺癌的治療有潛在的應用前景，但具體的作用機制尚未明確，需進一步研究證實。

［1］Bougeret C，Virone-Oddos A，Adeline E，et al.Cancer gene therapy mediated by CTS1，a p53 derivative：advantage over wild-type p53 in growth inhibition of human tumors overexpressing MDM2［J］.Cancer Gene Ther，2000，7（5）：789-798.

［2］Lin J，Jin X，Page C，et al.A modified p53 overcomes mdm2-mediated oncogenic transformation：a potential cancer therapeutic agent［J］.Cancer Res，2000，60（20）：5895-5901.

［3］Horikawa Y，Nadaoka J，Saito M，et al.Clinical implications of the MDM2 SNP309 and p53 Arg72Pro polymorphisms in transitional cell carcinoma of the bladder［J］.Oncol Rep，2008，20（1）：49-55.

［4］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

［5］Peng Y，Chen L，Li C，et al.Stabilization of the MDM2 oncoprotein by mutant p53［J］.J Biol Chem，2001，276（9）：6874-6878.

［6］Wang G，F(xiàn)iroz EF，Rose A，et al.MDM2 expression and regulation in prostate cancer racial disparity［J］.Int J Clin Exp Pathol，2009，2（4）：353-360.

［7］秦艷茹，金寒，王立東，等.食管癌前病變和癌組織中p15、p16、mdm2和p53蛋白的表達［J］.鄭州大學學報（醫(yī)學版），2006，41（1）：47-48.

［8］Ye Y，Li X，Yang J，et al.MDM2 is a useful prognostic biomarker for resectable gastric cancer［J］.Cancer Sci，2013，104（5）：590-598.

［9］陳飛，程琪，王立波，等.STAT3和MDM2在宮頸腺癌組織中的表達及意義［J］.中國婦幼保健，2014，29（19）：3154-3155.

［10］李大偉，張慶豐，張欣然.MDM2與p16在喉癌中的表達及其臨床病理意義［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，26（18）：802-805.

［11］姚冬穎，朱曉燕.結直腸癌中Bmi-1、p14ARF和Mdm2的表達及臨床意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30（4）：379-382.

（編輯 裘孝琦）

siRNAInhibitsthe Expression ofmdm2 and CellProliferation in MCF-7 Cells

GONGQi-yu1，JIKun2，ZHANGLi-yan2，WANGBo3，CHU Qi4，ZHANGMing-xuan4
（1.Department of Clinical Laboratory，Yakeshi City People′s Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.DepartmentofPathology，The Second ClinicalMedicalSchoolofInnerMongolia University forthe Nationalities；Molecular PathologicalResearch Institute of Inner Mongolia University for Nationalities；Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；4.Grade 2012 ClinicalMedicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo explore the expression of mdm2 in human cyclomastopathy，ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer tissues，and to study the effects of mdm2 siRNA on cell proliferation in MCF-7 cells.MethodsThe expression of mdm2 was studied by means of immunohistochemistry in cyclomastopathy，ductalcarcinoma in situ and invasive breastcancertissues.MCF-7 cells were transfected with pGCsiRNA-mdm2 and pGCsiRNA-scramble by Lipofectamine 2000.Cell proliferation was measured by MTT assay.ResultsThe results of immunohistochemistry indicated thatthe positive rates ofmdm2 was 100%in ductalcarcinoma in situ tissues and invasive breastcancertissues，which was only 20%in cyclomastopathy tissues.Compared with cyclomastopathy tissues，the positive rates of mdm2 protein was obvious increased in ductal carcinoma in situ tissues and invasive breast cancer tissues（P＜0.01）.Compared with mock and pGCsiRNA-scramble，pGCsiRNA-mdm2 significantly inhibited the survivalrates in MCF-7 cells（P＜0.01）.ConclusionMdm2 generally expressed in breastcancertissue and promote the process oftumorproliferation.

cyclomastopathy；ductal carcinoma in situ；invasive breast cancer；mdm2；RNAi

R73

A

0258-4646（2014）10-0892-05

遼寧省博士科研啟動基金（20111126）；遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃（LJQ2014113）

宮琦玉（1968-），女，副主任檢驗師，本科.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-09-03

網(wǎng)絡出版時間：