肖月星+劉海清+李林福+吳龍火

摘要：利用Hulth手術誘導法復制大鼠膝骨關節(jié)炎模型，利用光學顯微鏡、組織化學法觀察關節(jié)平面損害情況，通過ELISA法測定大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS含量，研究中藥九里香（Murraya exotica L.）醇提物對大鼠膝骨關節(jié)炎的防治作用。結果表明，治療組與模型組相比，九里香醇提物對關節(jié)平面具有顯著的保護作用，可提高大鼠血清中SOD含量、有效降低IL-1β、TNF-α及iNOS含量。

關鍵詞：九里香（Murraya exotica L.）；膝骨關節(jié)炎；IL-1β；TNF-α；SOD；iNOS

中圖分類號：R282；R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0126-04

Studies on Anti-knee Osteoarthritis Activity of the Ethanol Extracts of Murraya exotica L.

XIAO Yue-xing，LIU Hai-qing，LI Lin-fu，WU Long-huo

（College of Pharmacy，Gannan Medical University， Ganzhou 341000，Jiangxi，China）

Abstracts： Rat knee osteoarthritis mode was established by using Hulths operational method. The joint damage was observed by light microscope and histochemical methods. The contents of IL-1β， TNF-α， SOD， and iNOS in the rat serum were determined by ELISA to study the anti-knee osteoarthritis activity of the ethanol extracts of Murraya exotica（L.）. Results showed that the treated group could significantly protect joint from damage， elevate the content of SOD， effectively reduce the contents of IL-1β， TNF-α， and iNOS.

Key words： Murraya exotica L.； knee osteoarthritis； IL-1β； TNF-α； SOD； iNOS

收稿日期：2013-03-29

基金項目：贛南醫(yī)學院人才引進啟動基金項目（201102）；贛南醫(yī)學院校級課題（YB201012）

作者簡介：肖月星（1965-），男，江西贛州人，實驗師，主要從事中藥藥理學研究，（電話） 0797-8169634（電子信箱）8269634@163.com；通訊作者，

吳龍火（1980-），男，福建漳州人，副教授，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究，（電話）0797-8169775（電子信箱）longhw@126.com。

九里香（Murraya exotica L.）又稱千里香、滿山香等，為蕓香科九里香屬植物，具有行氣止痛、活血散瘀、祛風除濕等功效。骨性關節(jié)炎（OA）是一種常見的慢性關節(jié)疾病，1995年骨性關節(jié)炎專題研究會提出OA是力學與生物因素的共同作用導致軟骨細胞、胞外基質及軟骨下骨三者的降解和合成失衡的結果[1，2]。軟骨基質的正常結構與功能依賴于分解性代謝和合成性代謝的平衡，此平衡是通過細胞因子來調控的。IL-1β（白介素-1β）、TNF-α（腫瘤壞死因子α）及iNOS（誘導型一氧化氮合成酶）等均被認為與軟骨基質的降解和破壞有非常大的關系，均被認為是分解性因子[3，4]。本試驗通過復制膝骨關節(jié)炎模型，通過光學顯微鏡及組織化學法觀察九里香醇提物對關節(jié)平面的保護，并檢測大鼠血清內的IL-1β、TNF-α、SOD（超氧化物歧化酶）及iNOS的水平，以探討九里香對骨性關節(jié)炎的分子防治機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

九里香采自福建省漳州市，經(jīng)贛南醫(yī)學院藥學院李加林副教授鑒定為九里香，自然陰干，機械粉碎過40目篩。昆明大鼠，雄性，（200±20） g，均由江西省贛州市實驗動物中心提供[合格證號：SCXK（贛）2008-0002]。

WK-200B型高速藥物粉碎機，F(xiàn)A2004型精密電子天平，Leica組織切片機RM2235，ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。乙醇、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、甲醛、二甲苯等均為分析純。

1.2 試驗方法

取干燥九里香葉粉末1 kg，用70%乙醇進行回流提取3次，每次2 h。合并提取液并蒸去溶劑得到浸膏[5]。

1.2.1 大鼠膝骨關節(jié)炎模型 每組6只大鼠進行適應性飼養(yǎng)7 d后，按照Rogart等[6]的方法復制大鼠實驗性骨關節(jié)炎模型。常規(guī)消毒，將大鼠以3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥于手術臺上，在無菌條件下在右膝關節(jié)內側縱切開約2 cm，逐層分離，將臏骨向后向外翻，最大限度彎曲膝關節(jié)，顯露膝關節(jié)腔。用顯微器械切斷前交叉韌帶、內側負韌帶，完整切除內側半月板后，逐層縫合傷口，分籠飼養(yǎng)，允許自由活動。術后給予青霉素10萬U肌肉注射抗炎，連續(xù)注射5 d。治療組術后進行九里香70%乙醇提取物200、100、50 mg/kg劑量灌胃，空白對照組給予相同體積的CMC-Na，連續(xù)8周。在第八周末，將大鼠麻醉后，迅速剖開胸腔進行心臟取血5 mL，靜置20～30 min后，3 000 g離心10 min，取上層血清，-20 ℃冰箱保存，待檢測其中的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS等含量。取股骨內髁內側軟骨組織，用光學體式顯微鏡觀察軟骨表面的色澤及光滑情況后，迅速置于10%中性福爾馬林溶液中固定以待進行病理組織學檢查。

1.2.2 軟骨組織切片的制備 依據(jù)參考文獻[7]的方法進行大鼠軟骨組織切片的制備。

1.2.3 生化指標的測定 IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS等含量嚴格按照ELISA試劑盒提供的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 大鼠膝骨關節(jié)軟骨光學檢查和組織化學檢查

在第八周處死大鼠，立即打開關節(jié)腔分離組織取下股骨，進行光學顯微鏡觀察（圖1）。對照組（圖1A）大鼠軟骨表層光滑，呈藍白色，光澤好，無裂紋及軟化灶；關節(jié)滑膜表面光滑，無腫脹、增厚。模型組大鼠軟骨表面粗糙，顏色偏白色，可見有一個較大的潰瘍缺損（圖1B中箭頭指向），局部變薄，但未見有明顯的骨贅形成；滑膜存在不同程度增生、粘連，關節(jié)液明顯增多。50 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖1C）中，軟骨表面糜爛較為嚴重，充血顯著，關節(jié)滑膜表面增生腫脹，有輕度的粘連現(xiàn)象。100 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖1D）中，大鼠軟骨表面呈現(xiàn)較多的點狀凹陷糜爛，充血較為明顯，無裂紋及軟化灶；關節(jié)滑膜表面輕度增生腫脹，未見有明顯粘連現(xiàn)象。200 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖1E）中，大鼠軟骨表層有微點凹陷，稍微充血，無裂紋及軟化灶；關節(jié)滑膜表面輕度增生腫脹，未見有明顯粘連現(xiàn)象。

正常大鼠關節(jié)軟骨的組織形態(tài)學分層按Beniinghoff法可分為4層：表層、移行層、輻射層和鈣化層。組織形態(tài)學變化觀察（HE染色）發(fā)現(xiàn)，由圖2A可見，大鼠關節(jié)軟骨的4層結構清晰可辨，表層細胞小而扁平，向下細胞增大并呈柱狀排列，且排列整齊，潮線完整、明顯。圖2B的局部放大圖為圖2B-1，均為模型組圖，可見大鼠關節(jié)軟骨表面不光滑，有較大面積的潰瘍缺損，表面軟骨變薄，軟骨細胞變少，軟骨纖維增生明顯，可見一些軟骨細胞水腫、固縮，排列紊亂，4層結構不易分辨，潮線不完整，基質染色重度減低等。200、100、50 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖2C、D、E ）中可見，大鼠關節(jié)軟骨表面由基本平滑至出現(xiàn)有凹陷狀，表面軟骨厚度逐漸變薄，軟骨細胞數(shù)量減少，細胞腫大，排列逐漸不整齊，在50 mg/kg九里香70%乙醇提取液（圖2E）中，大鼠關節(jié)軟骨潮線不明顯。

2.2 大鼠膝骨關節(jié)軟骨的生化指標

由圖3A可知，九里香70%乙醇提取物不僅對大鼠膝骨關節(jié)炎引起的SOD活性降低起到一定的抑制作用，而且可以提高大鼠體內SOD活性，并表現(xiàn)出劑量的依賴性。連續(xù)灌胃8周后，200、100、50 mg/kg九里香70%乙醇提取物不同劑量組大鼠血清的SOD活性分別為136.7、130.8、113.6 U/mL，而模型組的SOD活性為101.5 U/mL，低于對照組的SOD活力（104.1 U/mL）。

大鼠血清中的iNOS活性變化中（圖3B），模型組大鼠體內的iNOS活性為24.7 U/mL，明顯高于對照組（17.6 U/mL）。與對照組相比，200 mg/kg九里香70%乙醇提取物可顯著降低大鼠體內的iNOS活性，為15.9 U/mL。而大鼠血清中的IL-1β及TNF-α（圖3C、D）也表現(xiàn)出對九里香70%乙醇提取物劑量的依賴性，并且各處理組與對照相比差異均達顯著或極顯著水平。在九里香70%乙醇提取物劑量為200、100、50 mg/kg時，大鼠血清中IL-1β的含量分別為148.2、156.8、195.4 pg/mL，TNF-α的含量分別為51.4、57.9、78.3 pg/mL。而在模型組中，IL-1β、TNF-α的含量分別為239.3、127.4 pg/mL，遠高于對照組（137.5、62.0 pg/mL）。

3 小結與討論

九里香作為一種傳統(tǒng)的中藥材，具有廣泛的藥理學作用，現(xiàn)代藥理學研究表明[8]，九里香具有抗生育、終止妊娠、抗菌、抗甲狀腺腫大、降血糖、麻醉鎮(zhèn)靜及增強免疫功能等作用，但鮮見關于九里香抗炎鎮(zhèn)痛及其在骨關節(jié)炎等方面的研究報道。本研究采用大鼠膝骨關節(jié)炎模型研究了九里香的抗炎鎮(zhèn)痛作用在骨關節(jié)炎方面的應用，結果表明九里香醇提物對大鼠骨關節(jié)炎的關節(jié)平面及軟骨細胞具有保護作用。

軟骨細胞的正常表型表達是軟骨基質保持穩(wěn)定的基礎，軟骨細胞功能的異常是骨關節(jié)炎變化的開始和關鍵[9]。OA是軟骨細胞合成和分解代謝活動的調節(jié)失衡，導致了細胞外基質成分的進行性丟失和軟骨細胞結構與功能的破壞。這些主要是軟骨細胞釋放的一些細胞因子造成的。如IL-1β不僅能抑制關節(jié)軟骨細胞合成特征性的基質成分Ⅱ型膠原，而且還可促進關節(jié)軟骨細胞發(fā)生反分化[10]。Bulina等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的血清及滑液中均檢測到高表達的IL-1β和TNF-α。利用TNF-α單克隆抗體——Infliximab，不僅可抑制OA中的TNF-α表達，而且也可抑制iNOS的合成，因此可顯著緩解OA病情的發(fā)展，目前已應用于臨床上OA的治療[12]。抑制IL-1β及TNF-α的表達可促進軟骨基質的合成，本研究中九里香醇提物（200、100、50 mg/kg）可顯著性降低大鼠血清中IL-1β和TNF-α的含量，緩解其對軟骨細胞合成基質的抑制作用。IL-1β可介導iNOS等促炎因子的合成，同時iNOS本身也是活性自由基，其可能是通過NF-κB信號途徑從而影響OA軟骨細胞的生理活動。200 mg/kg九里香醇提物可顯著降低iNOS的表達水平，同時也提高了SOD的活性水平，可有效抑制促炎因子的破壞作用。

在光學檢查中，九里香醇提物（200 mg/kg）表現(xiàn)出很好的保護膝關節(jié)平面的作用，這可能與其抑制了促炎因子的表達水平有關，抑制了骨關節(jié)炎的炎癥免疫反應，從而有效保護了關節(jié)軟骨細胞。因此，中藥九里香醇提物具有抗膝骨關節(jié)炎的藥理學作用，其可能的機制是與體內的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS的水平調節(jié)有關。

IL-1β和TNF-α又可通過NF-κB信號途徑誘發(fā)軟骨細胞的凋亡，在九里香醇提物治療中劑量逐漸減少，軟骨中軟骨細胞也逐漸減少，這也可能與凋亡過度有關。但目前關于九里香醇提物預防OA的分子機制還不是很清楚，有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] 李 彬，張 柳，胡宏宇，等.降鈣素在體內外實驗中對兔關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變及軟骨下骨骨代謝的影響[J].中國矯形外科雜志，2009，17（21）：1651-1656.

[2] CARON J P，F(xiàn)ERNANDES J C，MARTEL-PELLETIER J，et al. Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis： Suppression of collagenase-1 expression[J]. Arthritis & Rheumatism，1996，39（9）：1535-1544.

[3] TORZILLI P A， BHARGAVA M， PARK S， et al. Mechanical load inhibits IL-1 induced matrix degradation in articular cartilage[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（1）：97-105.

[4] VAN DE LOO A A， VAN DE BERG W B. Effects of murine recombinant interleukin 1 on synovial joints in mice： Measurement of patellar cartilage metabolism and joint inflammation[J]. Ann Rheum Dis，1990，49（4）：238-245.

[5] 吳龍火，劉昭文，許瑞安.九里香葉的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（21）：4435-4438.

[6] ROGART J N， BARRACH H J， CHICHESTER C O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage，1999，7（6）：539-547.

[7] 杜卓民.實用組織學技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社.1998.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.10.

[9] 李 夏. 骨關節(jié)炎軟骨細胞修復紊亂及鹿茸多肽對軟骨細胞的保護作用[D]. 長春：吉林大學，2008.

[10] HENROTIN Y， CLUTTERBUCK A L， ALLAWAY D， et al. Biological actions of curcumin on articular chondrocytes[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（2）：141-149.

[11] BULINA I， ANDERSONE D， SOCHNEV A， et al. Tumour necrosis factor α in rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients in blood serum and synovial fluid[J]. Ann Rheum Dis，2010，69：40.

[12] YUKSEL M G， ALLAART C F， WATT I， et al. Treatment with TNF-α inhibitor infliximab might reduce hand osteoarthritis in patients with rheumatoid arthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2010，18（10）：1256-1262.

（責任編輯 趙 娟）

參考文獻：

[1] 李 彬，張 柳，胡宏宇，等.降鈣素在體內外實驗中對兔關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變及軟骨下骨骨代謝的影響[J].中國矯形外科雜志，2009，17（21）：1651-1656.

[2] CARON J P，F(xiàn)ERNANDES J C，MARTEL-PELLETIER J，et al. Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis： Suppression of collagenase-1 expression[J]. Arthritis & Rheumatism，1996，39（9）：1535-1544.

[3] TORZILLI P A， BHARGAVA M， PARK S， et al. Mechanical load inhibits IL-1 induced matrix degradation in articular cartilage[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（1）：97-105.

[4] VAN DE LOO A A， VAN DE BERG W B. Effects of murine recombinant interleukin 1 on synovial joints in mice： Measurement of patellar cartilage metabolism and joint inflammation[J]. Ann Rheum Dis，1990，49（4）：238-245.

[5] 吳龍火，劉昭文，許瑞安.九里香葉的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（21）：4435-4438.

[6] ROGART J N， BARRACH H J， CHICHESTER C O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage，1999，7（6）：539-547.

[7] 杜卓民.實用組織學技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社.1998.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.10.

[9] 李 夏. 骨關節(jié)炎軟骨細胞修復紊亂及鹿茸多肽對軟骨細胞的保護作用[D]. 長春：吉林大學，2008.

[10] HENROTIN Y， CLUTTERBUCK A L， ALLAWAY D， et al. Biological actions of curcumin on articular chondrocytes[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（2）：141-149.

[11] BULINA I， ANDERSONE D， SOCHNEV A， et al. Tumour necrosis factor α in rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients in blood serum and synovial fluid[J]. Ann Rheum Dis，2010，69：40.

[12] YUKSEL M G， ALLAART C F， WATT I， et al. Treatment with TNF-α inhibitor infliximab might reduce hand osteoarthritis in patients with rheumatoid arthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2010，18（10）：1256-1262.

（責任編輯 趙 娟）

參考文獻：

[1] 李 彬，張 柳，胡宏宇，等.降鈣素在體內外實驗中對兔關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變及軟骨下骨骨代謝的影響[J].中國矯形外科雜志，2009，17（21）：1651-1656.

[2] CARON J P，F(xiàn)ERNANDES J C，MARTEL-PELLETIER J，et al. Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis： Suppression of collagenase-1 expression[J]. Arthritis & Rheumatism，1996，39（9）：1535-1544.

[3] TORZILLI P A， BHARGAVA M， PARK S， et al. Mechanical load inhibits IL-1 induced matrix degradation in articular cartilage[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（1）：97-105.

[4] VAN DE LOO A A， VAN DE BERG W B. Effects of murine recombinant interleukin 1 on synovial joints in mice： Measurement of patellar cartilage metabolism and joint inflammation[J]. Ann Rheum Dis，1990，49（4）：238-245.

[5] 吳龍火，劉昭文，許瑞安.九里香葉的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（21）：4435-4438.

[6] ROGART J N， BARRACH H J， CHICHESTER C O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage，1999，7（6）：539-547.

[7] 杜卓民.實用組織學技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社.1998.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.10.

[9] 李 夏. 骨關節(jié)炎軟骨細胞修復紊亂及鹿茸多肽對軟骨細胞的保護作用[D]. 長春：吉林大學，2008.

[10] HENROTIN Y， CLUTTERBUCK A L， ALLAWAY D， et al. Biological actions of curcumin on articular chondrocytes[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（2）：141-149.

[11] BULINA I， ANDERSONE D， SOCHNEV A， et al. Tumour necrosis factor α in rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients in blood serum and synovial fluid[J]. Ann Rheum Dis，2010，69：40.

[12] YUKSEL M G， ALLAART C F， WATT I， et al. Treatment with TNF-α inhibitor infliximab might reduce hand osteoarthritis in patients with rheumatoid arthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2010，18（10）：1256-1262.

（責任編輯 趙 娟）