王湛，楊軍，李建軍

（中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院骨科，沈陽110004）

新型骨科植入物鎂合金材料抗菌性能的體外實驗研究

王湛，楊軍，李建軍

（中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院骨科，沈陽110004）

In vitro ExperimentalStudy on the AntibacterialPropertiesof New Orthopedic Implant Material-magnesium Alloy

采用金黃色葡萄球菌/大腸桿菌與金屬材料共培養(yǎng)的體外實驗方法，探討骨科內(nèi)植入金屬材料——新型鎂合金的抗菌性能。采用分光光度計檢測不同培養(yǎng)時間混合培養(yǎng)液中的細菌含量。結果顯示：隨著培養(yǎng)時間的延長，鎂及鎂合金材料均呈現(xiàn)金黃色葡萄球菌/大腸桿菌生長抑制的現(xiàn)象，而與之相對照的目前在臨床上常用的骨科植入物——鈦合金未見細菌生長抑制的效果。

鎂合金；生物材料；骨折；骨內(nèi)置物；抗菌性

臨床上，固定是骨折治療的核心部分。20世紀60年代，由AO/ASIF組織提出的絕對穩(wěn)定以及堅強固定治療理念被廣為接受。近年來，隨著材料科學的進步，內(nèi)固定材料的選擇受到廣泛關注，而理想的內(nèi)固定材料應具有良好的生物相容性、良好的機械強度、合適的硬度、適當?shù)目山到庑约拜^少的并發(fā)癥。

目前，在骨缺損及骨折的臨床治療中廣泛應用的內(nèi)固定材料主要有不銹鋼、鈦合金以及鈷合金等金屬生物材料。自2l世紀初以來，以新型鎂合金為主要代表的具有生物可降解特性的新一代醫(yī)用金屬材料被人們所認識。鎂合金的優(yōu)勢在于其密度及彈性模量均與人體接近，可以有效緩解應力屏蔽效應對骨組織生長的不良影響，其降解產(chǎn)物鎂離子也是人體必需的常量元素之一［1］。此外，研究表明，鎂離子還具有促進成骨細胞增殖的特性，可以縮短骨折愈合的時間。由此可見，可降解的鎂合金成為了一種潛力巨大的新型植入物材料，被譽為“革命性的金屬生物材料”。

目前，國內(nèi)外關于鎂合金的研究主要集中于體內(nèi)降解的過程和機制、生物安全性、生物相容性等方面，關于鎂合金抗菌性能的研究較少。研究顯示，金黃色葡萄球菌與大腸桿菌是骨折內(nèi)固定術后感染與骨髓炎最常見的致病菌［2］。本研究擬采用金黃色葡萄球菌/大腸桿菌與金屬材料共培養(yǎng)的體外實驗方法，探討新型鎂合金的抗菌性能，旨在促進鎂合金材料在骨折等疾病治療中的有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料

鎂及鎂合金材料分別為：Mg、Mg3Zn、Mg3Zn1Ag、 Mg3Zn3Ag，鈦合金（Ti6Al4V）（東北大學材料各向異性與織構教育部重點實驗室提供）。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（中國醫(yī)科大學病原生物教研室提供）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：（1）金黃色葡萄球菌與金屬材料共培養(yǎng)實驗：將樣品分為單純金葡菌（S.aureus）組、金葡菌+Mg（S.aureus+Mg）組、金葡菌+Mg3Zn（S.aureus+Mg3Zn）組、金葡菌+ Mg3Zn1Ag（S.aureus+Mg3Zn1Ag）組、金葡菌+Mg3Zn3Ag（S. aureus+Mg3Zn3Ag）組、金葡菌+Ti6Al4V（S.aureus+Ti6Al4V）組，共6組，每組5份樣品。（2）大腸桿菌與金屬材料共培養(yǎng)實驗：將樣品分為單純大腸桿菌（E.coli）組、大腸桿菌+Mg（（E. coli+Mg）組、大腸桿菌+Mg3Zn（E.coli+Mg3Zn）組、大腸桿菌+ Mg3Zn1Ag（E.coli+Mg3Zn1Ag）組、大腸桿菌+Mg3Zn3Ag（E. coli+Mg3Zn3Ag）組、大腸桿菌+Ti6Al4V（E.coli+Ti6Al4V）組，共6組，每組5份樣品。

1.2.2 細菌培養(yǎng)基制備及細菌培養(yǎng)：稱取牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g，在石棉網(wǎng)上加熱溶于600 mL蒸餾水中，利用HCl及NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.4，加入蒸餾水定容至1 L。分裝入三角燒瓶內(nèi)，包扎，加塞后，以0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌15 min，待用。

利用細菌比濁儀，分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌株以制備好的肉湯培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至0.5麥氏單位（菌量約為1×108/mL），分別取1 mL接種至100 mL肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，放入37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，作為細菌原液。

1.2.3 金屬合金材料處理：將鈦合金塊及4種鎂合金塊用砂紙打磨光滑，去除表面氧化層。在無水乙醇中超聲波震蕩清洗15 min，然后在蒸餾水中超聲波震蕩清洗15 min，分裝后以0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2.4 細菌與金屬合金材料混合培養(yǎng)：在10 mL PE離心管內(nèi)放入1個直徑1 cm、高1 cm的圓柱形合金塊。每毫升浸提液體積對標準表面積比例參照GBP16886.12-2000［3］，浸提比例為1.25 cm2/mL，每個管內(nèi)加入3 mL肉湯培養(yǎng)基，再按照實驗分組，分別加入0.3 mL已制備好的相應的細菌原液，做好標記。對照組加入3 mL肉湯培養(yǎng)基，及0.3 mL已制備好的相應的細菌原液。將離心管置于37℃、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)。

在混合培養(yǎng)的第0、2、4、8、24、48、72 h取出，采用分光光度法測定細菌含量。將培養(yǎng)液加入96孔板中，在490 nm波長下，測定OD值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有實驗數(shù)據(jù)采用表示，各組均數(shù)間差異的比較應用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌與金屬合金材料共培養(yǎng)實驗結果

如表1所示：單純金葡菌組隨著培養(yǎng)時間的延長菌量逐漸增多，24 h達到峰值，約為基礎菌量（0 h）的5.28倍，并持續(xù)保持近似水平至72 h。金葡菌+Ti6Al4V組菌量的變化趨勢與單純金葡菌組相似，24 h時明顯增多，48 h達到峰值，約為基礎菌量（0 h）的5.24倍。而金黃色葡萄球菌與鎂及鎂合金共培養(yǎng)組則顯示出明顯的抑菌效果，金葡菌+Mg組菌量峰值出現(xiàn)在24 h，金葡菌+Mg3Zn、金葡菌+Mg3Zn1Ag及金葡菌+Mg3Zn3Ag組均出現(xiàn)在8 h，各組分別為基礎菌量的1.83、2.16、2.17和2.13倍，明顯低于單純金葡菌組和金葡菌+ Ti6Al4V組，特別是24～72 h期間的長期抑菌效果尤為明顯。金葡菌+Mg組也顯示出較強的抑菌效果。說明在此培養(yǎng)條件下鎂具備抑菌能力。在鎂合金材料中，隨著合金材料中銀（Ag）含量增多，抑菌效果也出現(xiàn)增強的趨勢。

2.2 大腸桿菌與金屬合金材料共培養(yǎng)實驗結果

表1 不同時間點金黃色葡萄球菌與金屬合金塊混合培養(yǎng)液OD490nm值

表1 不同時間點金黃色葡萄球菌與金屬合金塊混合培養(yǎng)液OD490nm值

注：1）與單純金葡菌組比較，P＜0.01；2）與金葡菌+Ti6Al4V組比較，P＜0.01.

如表2所示：隨著培養(yǎng)時間的延長，單純大腸桿菌組菌量逐漸增多，24 h開始明顯增多，72 h達到峰值，約為基礎菌量（0 h）的4.71倍。大腸桿菌與鈦合金共培養(yǎng)組菌量的變化趨勢與單純大腸桿菌組相似，24 h達到峰值，約為基礎菌量（0 h）的4.63倍，并持續(xù)保持高水平。相反，大腸桿菌與鎂及鎂合金共培養(yǎng)則顯示出明顯的抑菌效果，大腸桿菌+Mg組、大腸桿菌+Mg3Zn組、大腸桿菌+Mg3Zn1Ag組及大腸桿菌+ Mg3Zn3Ag組菌量峰值均出現(xiàn)在8 h，分別為基礎菌量的1.89、1.87、1.79和1.71倍，明顯低于單純大腸桿菌組和大腸桿菌+Ti6Al4V組。同樣，24～72 h的長期抑菌效果更為明顯。提示了鎂的抑菌效果，而且也同樣表現(xiàn)出隨著合金中銀（Ag）含量增多，對大腸桿菌的抑菌效果也逐漸增強的效應。

表2 不同時間點大腸桿菌與金屬合金塊混合培養(yǎng)液OD490nm值

表2 不同時間點大腸桿菌與金屬合金塊混合培養(yǎng)液OD490nm值

注：1）與單純大腸桿菌組比較，P＜0.01；2）與大腸桿菌+Ti6Al4V組比較，P＜0.01.

3 討論

一般情況下具有抗菌效果的金屬元素主要以其離子形式發(fā)揮作用，在高濃度金屬離子的局部環(huán)境中，通過各種機制影響細菌的生長。鎂在液體環(huán)境中能夠通過電化學反應降解，產(chǎn)生氫氧化鎂及氫氣，反應式如下：

陽極反應：Mg→Mg2++2e

陰極反應：2H2O+2e→2H2+2OH-

產(chǎn)物生成反應：Mg2++2OH-→Mg（OH）2

總反應：Mg+2H2O→Mg（OH）2+H2

在液體環(huán)境中，Mg（OH）2會不斷積聚在鎂的表面形成保護層，能夠減慢鎂的降解速率［4］，這是鎂合金適合應用于體內(nèi)內(nèi)固定材料所需的特質(zhì)。

細菌正常生長所需環(huán)境的最適pH值為7.4～7.6［5］。根據(jù)上述反應式，鎂在降解時會產(chǎn)生大量的OH-，造成局部的pH值升高。這種局部的堿性環(huán)境會對細菌的正常生長產(chǎn)生影響，從而可以達到抗菌的目的。此外，鎂作為二價金屬離子抑菌的機制還可能涉及以下方面：當細菌胞膜外存在高濃度的金屬陽離子時，會使正常細胞內(nèi)外極化狀態(tài)發(fā)生改變，造成新的離子濃度差，從而阻礙一些細胞生長所必需的物質(zhì)的轉運。研究表明，某些金屬離子可以使細胞內(nèi)部分酶失活，影響細胞正常的生化反應，導致細胞的能量與物質(zhì)代謝紊亂，進而抑制細菌的生長。金屬離子使細胞內(nèi)的酶失活的原理目前還不清楚，有學者認為可能是正價金屬離子與巰基結合，置換出酶本身的離子，使其正常結構遭到破壞而失活［3］。另外，進入細胞內(nèi)的金屬離子也可以破壞細胞的核酸結構，影響細胞的正常分裂［6］。

鎂合金常見的構成元素有鋅、鋁、錳、鈣、銀以及稀土元素等，這些元素可以影響鎂的物理性能和機械性能。當這些金屬元素與鎂結合時，可以有效的提高其機械強度和韌性。Witte等［7］報道了4種鎂合金（AZ31、AZ91、WE43、LAE442）和聚乳酸材料（SR-PLA96）在動物體內(nèi)的降解情況。通過實驗發(fā)現(xiàn)，鎂與添加的適量合金元素能有效改善材料的機械強度及在體內(nèi)的降解速率，其中含有鋅的2種合金AZ31（3%Al+ 1%Zn）及AZ91（9%Al+1%Zn）具有相對較快的降解速率。由于鋅離子是人體的一種基本微量元素，與一系列人體正常生理活動密切相關，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中也起著重要的作用。因此，本研究選擇金屬鋅作為鎂合金的一種重要組成部分。而加入金屬元素銀可以更好地提高鎂合金的機械性能，且銀離子也具有一定的抗菌性，可以增強鎂合金的抑菌效果。關于Ag+的抗菌性原理，有研究認為Ag+能夠從溶液中降解出來，直接與細菌接觸，抑制及殺滅細菌［8］，Ag+結合蛋白酶巰基的能力很強，能夠破壞細胞內(nèi)蛋白酶的功能，使細菌的正常生長繁殖受到抑制［9］。

鎂合金與目前骨科常用的具有抗菌素涂層的鈦合金植入物相比，具有更好的生物安全性、機械性能以及生物相容性。Castellani等［10］將鎂合金短棒植入大鼠股骨，與鈦合金相對比，24周后鎂合金組的拔出力明顯高于鈦合金組，提示鎂合金比鈦合金具有更好的植入物-骨界面強度，且鎂合金組未出現(xiàn)炎性反應及血細胞數(shù)量、比例變化，肝、腎功能及血中電解質(zhì)濃度亦無異常。此外，鎂合金的可降解特性可避免骨折愈合后行二次植入物取出手術，不僅可以減輕患者的痛苦，也可減少臨床的風險和負擔。

目前的研究已經(jīng)證實，鎂合金具有可降解性、良好的生物相容性和一定的機械強度，是一種非常有潛在應用價值的新型金屬植入物材料。本研究結果亦發(fā)現(xiàn)鎂及鎂合金與革蘭陽性菌——金黃色葡萄球菌及革蘭陰性菌——大腸桿菌共培養(yǎng)時均顯示出明顯的抗菌作用，這將有利于防止骨折內(nèi)置物感染以及骨髓炎的發(fā)生。然而，目前尚無鎂合金抗菌性體內(nèi)實驗的完善資料，此外，還需對鎂合金的非細胞毒性以及體內(nèi)組織的生物學反應進行深入系統(tǒng)的研究，以期將其盡早、安全、有效地應用于臨床。

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（編輯 王又冬）

R318

A

0258-4646（2014）12-1142-03

王湛（1990-），男，碩士研究生.

楊軍，E-mail：yangj1@sj-hospital.org

2014-10-10

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