龍麗坤 李蔥蔥 張明 李飛武

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院，長春 130033）

bar基因表達蛋白單克隆抗體制備及ELISA 檢測方法的建立

龍麗坤 李蔥蔥 張明 李飛武

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院，長春 130033）

通過原核表達誘導bar基因表達蛋白，通過表達蛋白免疫BALB/c 小鼠，經(jīng)細胞融合、篩選克隆，獲得一個雜交瘤細胞株。以兔多抗作為捕獲抗體，鼠單抗作為示蹤抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 作為檢測系統(tǒng)，建立了轉基因植物bar基因檢測雙抗夾心ELISA 方法，試驗證明利用該抗體建立的ELISA檢測方法含有轉bar基因的轉基因玉米成分具較好的特異性和靈敏度。為轉基因成分的檢測提供了安全、快速、準確的技術手段。

bar基因 雜交瘤細胞 單克隆抗體 轉基因檢測

隨著轉基因技術的不斷發(fā)展，人們對于轉基因生物及其產(chǎn)品的安全性的關注度越來越高，為此，包括我國在內(nèi)的50多個國家和地區(qū)建立了標識制度，對轉基因產(chǎn)品實行嚴格監(jiān)管。標識監(jiān)管制度的實施，依賴于快速、靈敏、準確的檢測方法。目前轉基因產(chǎn)品檢測技術主要分為兩大類，一類以外源DNA為檢測對象，如PCR、LAMP等；另一類以外源基因表達蛋白質(zhì)為檢測對象，如ELISA、快速檢測試紙條等［1］。

轉基因外源蛋白檢測方法是以純度好、效價高的蛋白抗體與抗原蛋白的特異性結合為基礎。目前轉基因品種中外源蛋白抗體的制備和方法應用，針對Cry1Ab、Cry1Ac等Bt蛋白，CP4-EPSPS蛋白，磷酸酶II等蛋白的檢測方法已廣泛應用［2］。bar基因，編碼蛋白—膦絲菌素乙酰轉移酶（PAT），該基因廣泛應用于基因工程育種中，也是遺傳轉化中的標記基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin（PPT）為活性成分的除草劑［3］。隨著轉基因食品的快速發(fā)展，國外轉bar基因作物和食品大量進入我國，轉bar基因的食品檢測技術是轉基因食品安全性評價的重要組成部分，其技術研究具有重要的意義。目前，國內(nèi)對于bar基因表達PAT蛋白的檢測研究相對較少［4］。研究者多利用多克隆抗體進行檢測方法研究，但多克隆抗體制備相對復雜，產(chǎn)量較低，抗體穩(wěn)定

性和檢測重復性具有一定局限性。高旭東等［5］的研究僅制備了表達PAT蛋白單克隆抗體的細胞株，如用于酶聯(lián)免疫檢測方法仍有待于對抗體特異性和效價進行進一步驗證。

本研究針對檢測Bar蛋白作為轉基因作物或食品常用篩選方法，制備了高效PAT蛋白單克隆抗體，旨為利用聯(lián)免疫技術快速檢測植物、食品耐抗除草劑轉基因成分提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和細胞 pET-28a載體載體E. coli DH5α、BL21感受態(tài)細胞，鼠源腎細胞，SP2/0 骨髓瘤細胞均購自上海生工生物技術公司。

1.1.2 試驗動物 BALB/c 雌性小鼠由北京鼎國生物公司提供。

1.1.3 轉基因標準樣品 轉基因玉米及其成分含量樣品，由農(nóng)業(yè)部轉基因環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（長春）制備并提供。

1.1.4 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、反轉錄酶、LA Taq DNA 聚合酶均購自TaKaRa 公司；pMAL 融合蛋白表達與純化試劑盒購自NEB 公司；蛋白Marker 購自Fermentas 公司；弗氏佐劑、PEG、HAT、HT、8-氮鳥嘌呤（8-AG）、鄰苯二胺（OPD）均購自Sigma 公司；HRP 標記羊抗鼠IgG（HRPIgG）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；SBA ClonotypingTMSystem/HRP 抗體亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotechnology 公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 從數(shù)據(jù)庫中檢索商業(yè)化載體序列，進行核苷酸和氨基酸序列比對。對核酸序列進行密碼子優(yōu)化，使其更適于大腸桿菌中表達，并保證氨基酸序列不變。序列確定后，5'端引入BamH I酶切位點，3'端引入Hind III酶切位點，最終設計并確定擴增bar基因全長的引物序列為：BarF：5'-CGCGGATCCATGTCTCCG-3' BarR：5'-CCCAAGCTTGATTTCGGTAAC-3' 擴增長度為：567 bp。

1.2.2 基因擴增和表達 以合成引物序列擴增bar基因全長，用BamH I和Hind III內(nèi)切酶分別酶切pET-28a載體，并將擴增片段連接入pET-28a載體，連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞；利用PCR擴增鑒定陽性質(zhì)粒，并將陽性重組質(zhì)粒命名為pET-Bar。提取質(zhì)粒pET-Bar并轉化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞。篩選陽性克隆。挑取含pET-Bar質(zhì)粒的單克隆菌落，接種于100 mL含有氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基（用LB（Amp+）表示）中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日用LB（Amp+）稀釋至1 000 mL，37℃培養(yǎng)至OD600=1左右，加IPTG至終濃度為1 mol/L。37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。4℃，5 000 r/min離心10 min，收集沉淀并用PBS洗滌。

1.2.3 原核抗原蛋白分離 灌制10%分離膠60 mL和5%濃縮膠15 mL，灌膠。上樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳。電壓100 V，電泳6-7 h。終止電泳后，用冷0.1 mol/L KCl浸泡膠 2-3 min，切下目的條帶置透析袋內(nèi)。將透析袋置于水平電泳洗脫裝置內(nèi)，60 V 洗脫過夜。次日100 V繼續(xù)洗脫1 h。反轉電極向相反方向洗脫3-5 min。吸出透析帶內(nèi)液體，蔗糖包埋濃縮，PBS透析。

1.2.4 動物免疫、細胞融合、篩選、克隆及MAb 制備 用純化后的Bar蛋白免疫6 周齡雌性BALB/c 小鼠，利用間接ELISA 篩選方法對上清進行檢測，具體參照文獻［6，7］方法進行。采用液相有限稀釋法進行細胞克隆。

取20-22 g Balb/c雌性小鼠，每只腹腔注射0.5 mL降殖烷（2，6，10，14- Tetramethylpen- tradecane，Janssen Chimica公司）。一周后，每只小鼠腹腔注射約2×106個雜交瘤細胞。7-10 d后小鼠腹部顯著膨隆，收集腹水。

1.2.5 MAb 亞類測定 按照SBA ClonotypingTMSystem/HRP 抗體亞類試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 ELISA檢測方法的建立 方陣試驗確定兔抗bar基因蛋白多抗與McAb 最佳工作濃度［8，9］。以兔抗bar基因 IgG包被液和單抗稀釋液濃度梯度，按照多抗包被-封閉-加樣-加單抗-加二抗-顯色與終止的程序進行。在酶標儀上讀取OD450nm。以陽性孔OD 值接近1，P/N 值最大時，確定兔抗PPV IgG 和McAb 的最大稀釋度為其最佳工作濃度。以確定的最佳單抗和多抗?jié)舛茸鳛镋LISA檢測體系的關鍵參數(shù)，進行樣品檢測。

2 結果

2.1 PAT蛋白抗原表達與分離

利用設計的引物，進行優(yōu)化密碼子的bar基因全序列擴增，擴增條件為95℃，5 min；95℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，擴增的片段經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測為567 bp特異性片段，見圖1。并經(jīng)過測序鑒定，驗證了與設計片段序列的一致性。

圖1 bar基因全長的擴增圖譜

獲得的567 bp的bar基因片段克隆至pET-28a載體，表達載體在IPTG誘導6 h后能穩(wěn)定表達PAT融合蛋白。融合蛋白以包涵體形式存在，約占菌體總蛋白的10%。其分子量約為27 kD（圖2）。獲得的純化的PAT蛋白為本試驗所用抗原。

2.2 雜交瘤細胞篩選和單克隆抗體的純化

每只小鼠200 μg Bar蛋白腹腔注射，第3次免疫1周后，進行第4次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠尾部，把吸取的0.1 mL溶于PBS的PAT蛋白，注射入小白鼠尾部靜脈。

免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/O融合并進行雜交瘤細胞篩選；按照文獻方法進行，克隆采用有限稀釋法進行，準確計數(shù)后進行系列稀釋到1 mL含10個細胞，克隆后，選取單個細胞生長集落孔上清進行檢測，從中選取1個陽性值最高的孔再進行克隆，直至檢測陽性率為100%。本研究獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗PAT蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將雜交瘤細胞株命名為4C2，于2012年7月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6341。

2.3 單克隆抗體的純化

小鼠腹腔注射約2×106個雜交瘤細胞。收集腹水。12 000 r/min離心30 s，去除沉淀和上層油脂，收集中段液體。并用PBS透析。平衡Protein A Sepharose-4B層析柱（Pharmacia公司）。用結合緩沖液1稀釋樣品后通過層析柱。待流出液體的OD值為0.01時，用0.1 mol/L檸檬酸鈉（pH2.6）洗脫層析柱，收集洗脫液。用5 mol/L Tris（pH8.8）調(diào)節(jié)pH至7.0，PBS透析。純化的抗體進行SDS-PAGE電泳，如圖3所示，單克隆抗體的分子量約147 kD，在還原劑的作用下，抗體分解為兩個片段，其中重鏈50 kD，輕鏈25 kD。

圖3 純化單抗的SDS-PAGE電泳圖

2.4 MAb 腹水效價測定及亞類鑒定結果

將分離純化的PAT蛋白用包被緩沖液進行稀釋，加入酶標板中（100 μL/孔），PAT蛋白的包被濃度為10 μg/mL；37℃孵育2 h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標板。將1 g非轉基因大豆葉片總蛋白加入10 mL包被緩沖液中，在研缽中研磨，得到陰性對照液，將陰性對照加入酶標板中（100 μL/孔），即為陰性對照孔；37℃孵育2 h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標板。每孔加入100 μL含5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液，37℃孵育30 min，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標板。

每孔加入100 μL上述純化得到的單克隆抗體或其稀釋液（用酶標抗體稀釋緩沖液進行稀釋），37℃孵育2 h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標板。每孔加入100 μL酶標二抗工作液，37℃孵育2 h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標板。每孔加入100 μL底物溶液，室溫避光孵育60 min后，用酶標儀測定450 nm波長下的吸收值。

用將吸收值為陰性對照孔兩倍以上的孔判斷為陽性孔。雜交瘤細胞培養(yǎng)上清、小鼠腹水及純化后抗體的結果，見表1。

表1 單克隆抗體4C2的效價

ISO-1 Capture ELASA試劑盒購自Sigma公司。取待測雜交瘤細胞上清液15 mL，加等量飽和硫酸胺，混勻后4℃過夜。次日10 000 r/min離心10 min，沉淀溶于500 mL去離子水。羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM 按1∶1 000稀釋后包被96孔板，3℃作用1 h。PBS清洗，每孔加待測上清50 μL，室溫作用1 h。加HRP-羊抗鼠二抗，室溫作用30 min。OPD顯色。No 6341細胞株分泌的單克隆抗體為IgG1亞類，結果如表2所示。

表2 單克隆抗體的亞類鑒定

2.5 雙抗夾心ELISA 檢測方法的建立

用包被液將兔抗Bar基因 IgG 作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 稀釋，100 μL/孔，每個稀釋度一行，4℃過夜包被抗體；用100 μL 3% BSA作封閉劑，37℃封閉3 h；加入樣品、PBS 空白對照，37℃ 40 min；加McAb 用稀釋液將McAb 作1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀釋，加入酶標板中，每個稀釋度作兩列，37℃作用40 min，；加酶標二抗加入1∶5 000 稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37℃溫浴40 min，（以上步驟每次操作前均洗滌3次，并拍干液體）；加入新配制的TMB 底物顯色液避光顯色10-15 min，加入終止液，50 μL/孔，在酶標儀上讀取OD450nm。以陽性孔OD 值接近1，P/N 值最大時，兔抗PPV IgG 和McAb 的最大稀釋度為其最佳工作濃度。確定的兔抗PPV IgG包被濃度為1∶3 200；單抗稀釋倍數(shù)為1∶800。

2.6 特異性和靈敏度試驗

成分含量為1%、10%和100%的轉基因玉米材料，所含轉基因成分分別為Bt176（含bar基因）、T25（含bar基因）、MON810（不含bar基因）、GA21（不含bar基因）各1 g加入10 mL樣品抽提緩沖液中，并研磨。提取的蛋白作為待測樣本液，利用本研究建立的雙抗夾心ELISA法檢測，含有bar基因成分的樣本，1%和10%含量均檢測bar基因表達陽性，而含有其他轉基因成分的樣本，為檢測陰性。該結果表明，制備的單克隆抗體與非轉bar基因植物不發(fā)生交叉反應，而與Bt蛋白、EPSPS蛋白無特異性反應，依據(jù)此單抗建立的ELISA檢測方法具有檢測bar基因表達蛋白的良好特異性。從檢測靈敏度來講，此方法能夠檢出含bar基因轉基因成分含量為1%的產(chǎn)品。對加工品的檢測和與其他轉基因植物內(nèi)源蛋白的檢測特異性，有待于進一步研究證明。

3 討論

隨著國內(nèi)外對轉基因產(chǎn)品檢測研究的深入以及各國對轉基因產(chǎn)品檢測要求的提高，迫切地需要更準確、快速、安全、高效且成本低廉的檢測技術的問世。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）用于間接檢測轉基因表達的目的蛋白質(zhì)，由于其快速、靈敏、可定量操作、簡便、無需貴重儀器設備、且對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測，在轉基因成分快速檢測領域有著極高的應用價值，其已被廣泛用于轉基因作物中外源基因表達的靶蛋白質(zhì)水平的分析測定［10］。美國FDA 已研究出用雙夾心ELISA 法檢測食品中是否含有轉基因玉米成分。EnviroLogix ELISA試劑盒可用于測定玉米中的Cry9C 蛋白，在同一實驗室和實驗室間共測定了9 種含玉米的食品，測定結果的重現(xiàn)性很好。Lipp等［11］使用ELISA 法，通

過抗體特異性地與CP4-EPSPS（5- 烯醇丙酮酰莽草酸-3- 磷酸合酶，來源于農(nóng)桿菌CP4）蛋白結合，檢測 抗草甘膦大豆（Rundup ready soybean，RRS）。對于bar基因表達的PAT蛋白的檢測方法研究，國外已有相關試劑盒產(chǎn)品，但價格昂貴，不適用大批量篩選應用，而國內(nèi)的檢測方法研究普遍使用多克隆抗體，應用也僅限于實驗室內(nèi)部的初篩，因此開發(fā)穩(wěn)定的，具有自主知識產(chǎn)權的PAT蛋白檢測方法和產(chǎn)品，是本研究的任務之一。

圖4 轉基因玉米進行的ELISA方法特異性檢測

本研究制備了表達PAT蛋白的單克隆抗體，并利用該抗體建立的ELISA 檢測方法，通過轉基因樣品的驗證，證實其與其他蛋白無交叉反應，效價高，達到107以上，并具有較高的檢測靈敏度。檢測指標滿足國內(nèi)檢測標準的要求，有較強的實用性，此方法的進一步完善，有望為我國轉基因成分監(jiān)督和監(jiān)測提供快速、安全、低成本的方法，為轉基因作物安全監(jiān)管提供了有力保障，具有良好應用價值。

4 結論

利用原核表達的PAT蛋白免疫小鼠，獲得純化抗PAT蛋白，并通過雜交瘤篩選技術獲得了分泌一株抗PAT蛋白細胞株。利用該單克隆抗體本研究初步建立了檢測bar基因表達蛋白ELISA檢測方法。

［1］許文濤 , 白衛(wèi)濱, 羅云波 , 等. 轉基因產(chǎn)品檢測技術研究進展［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2008, 16（4）：714-722.

［2］張占軍, 王富花.酶聯(lián)免疫吸附技術及其在食品安全檢測中的應用［J］.食品研究與開發(fā), 2011, 32（1）：157-159.

［3］許文濤, 黃昆侖, 鄧愛科, 羅云波. 轉基因產(chǎn)品中PAT蛋白的酶聯(lián)免疫檢測［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2006, 14（2）：250-254.

［4］邱龍, 馬崇烈, 劉博林, 章旺根. 耐除草劑轉基因作物研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2012, 45（12）：2357-2363.

［5］高旭東, 王永志, 時圣鳳, 等. 膦絲菌素乙酰轉移酶的表達及單克隆抗體制備［J］細胞與分子免疫學雜志, 2013（5）：500-503.

［6］Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity［J］. Nature, 1975, 256：495-497.

［7］華黎, 廖婧, 胡麗玲, 等. 聚乙二醇誘導細胞融合最適條件的篩選［J］.中國醫(yī)院藥學雜志, 2012, 21（3）：50-53.

［8］王凈, 李剛, 王鵬, 等. 抗CPV-2a 單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA 檢測方法的建立［J］.基因組學與應用生物學, 2011, 30（3）：357-363.

［9］劉志浩, 高麗麗, 王新桐, 等. 轉基因玉米中膦絲菌素乙酰轉移酶雙抗體夾心ELISA 檢測方法的建立［J］.西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版, 2013, 41（11）：40-45.

［10］孔君, 劉箐, 韓躍武, 等. 單克隆抗體制備技術的最新進展及應用前景［J］.免疫學雜志, 2011, 27（2）：170-173.

［11］Lipp M, Anklam E, Stave JW. Validation of an immunoassay for detection and quantitation of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference materials：interlaboratory study［J］. Journal of AOAC International, 2000, 83（9）：919-927.

（責任編輯 狄艷紅）

Development of A Monoclonal Antibody Sand wich ELISA for Detection of bar Gene Transgenic Plant and Element

Long Likun Li Congcong Zhang Ming Li Feiwu
（Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033）

This study induced prokaryotic express Bar protein, by protein Immunity of BALB/c mice, cell fusion and screening clones, we obtained a hybridoma cell line. In this study, using rabbit polyclonal IgG and hybridoma cells secreting monoclonal antibodies we established sandwich ELISA method for detection of bar gene intransgenic plant which showed good specificity and sensitivity . This study provides rapid and accurate.technical tool for a secure monitoring of GMO.

bar gene Hybridoma Monoclonal antibody GMO detection

2014-03-13

吉林省人力資源與社保廳項目博士后啟動項目

龍麗坤，女，博士，副研究員，研究方向：轉基因植物環(huán)境安全檢測；E-mail：longlikun@126.com.

李飛武，男，碩士，副研究員，研究方向：轉基因檢測技術；E-mail：lifeiwu3394@sina.com