曾柏全，許志，張陽陽

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410004）

響應(yīng)面法優(yōu)化放線菌產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件

曾柏全，許志，張陽陽

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410004）

采用紫外與60Co-γ射線誘變獲得的高產(chǎn)纖維素酶菌株系為研究對象，研究產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件，結(jié)果表明：通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合碳源，蛋白胨，KH2PO43個因素的取值范圍。利用SAS9.1軟件對碳源、氮源以及KH2PO4進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明：X1（氮源）=4.05g，X2（復(fù)合碳源）=3.69g，X3（KH2PO4）=4.68%，CMCase最大酶活為94.8688IU/mL。

放線菌；纖維素酶；響應(yīng)面

纖維素類物質(zhì)是自然界中存在的最廉價、最豐富的一類可再生資源[1]。纖維素酶（celluase）可廣泛用于食品、紡織、造紙、洗滌、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取、生物能源等眾多領(lǐng)域，特別是在紡織、洗滌、造紙和生物能源等工業(yè)應(yīng)用上具有重要地位[2-3]。肖舫[4]等通過對發(fā)酵條件優(yōu)化，使羧甲基纖維素鈉活性達(dá)到1.548 IU/mL。陳偉紅[5]經(jīng)過誘變選育后進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化將FPAase酶活提高到40.8 IU/mL。佟勇[6]等篩選出嗜熱放線菌，并對其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，獲得較高的纖維素酶活。目前，大量的纖維素物質(zhì)沒有被利用，運(yùn)用纖維素酶對纖維素進(jìn)行充分利用，將農(nóng)副產(chǎn)品如糠醛渣、蔗糖渣、造紙廢料等纖維素材料轉(zhuǎn)化成糖和蛋白質(zhì)，對緩解全球能源危機(jī)，食品和飼料資源緊張以及環(huán)境污染有著重大意義[7]。本實(shí)驗(yàn)鑒于纖維素酶酶活不高，纖維素酶供不應(yīng)求，對產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，來提高纖維素酶活。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20 g，水1 000mL；篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H20 0.5g，KH2PO41 g，NaCl0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，水1 000mL；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g，酵母浸出膏0.5 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H20 0.3 g，CMC-Na 20 g，水1 000mL。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

全自動高壓蒸汽滅菌器：DAIHAN LABTECH Co.，LTD；SW-CJ-1F型水平超凈工作臺：江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；PYX-280S-A型生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；TGL-16高速臺式冷凍離心機(jī)：湘江儀器廠；UV-1700紫外可見分光光度計：日本島津公司；60Co-γ放射儀：湖南省原子能研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將菌株由斜面接種到50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃，175 r/min的條件下培養(yǎng)3 d。然后按4%的接種量接入裝有60mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)6 d。

1.3.2 纖維素酶活力的測定

酶活測定均用DNS法[8]測定酶解產(chǎn)生的還原糖量，酶活單位采用國際定義[9]方法：其中CMC酶活和FPA酶活在50℃，pH6.0條件下，以1mL酶液1min分解底物生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 分析因素的選取以及分析方案

通過復(fù)合誘變的初篩與復(fù)篩最終得到突變株UV-Co16，以此菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)選取對發(fā)酵條件影響較大的碳源、氮源、磷酸鹽為自變量，并以+1，0，-1代表自變量的高，中，低水平，以CMCase為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計見表1，實(shí)驗(yàn)方案以及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table1 Factors and Levels for Box-Behnken design

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Program and experimental results of Box-Behnken design

2.1.2 回歸方程的建立與分析

利用SAS9.1軟件（Analysis of variance）ANOVA程序?qū)Ρ?數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，結(jié)果見表3，剔除不顯著的影響因素，即影響因素的P＜0.05，得到響應(yīng)值（Y1）CMCase酶活的回歸方程為：Y1=8 792.935+ 971.895 6X1+1180.741X2+863.428 9X3-2 166.05X1X1-1 048.935X1X3-2 397.818X2X2-2 818.473X3X3。

表3 CMCase的ANOVA分析結(jié)果Table3 Results of ANOVA for the activity of CMCase

回歸方程中，變量的正系數(shù)表明該變量的正向增大可以引起響應(yīng)值的增大；負(fù)的二次項(xiàng)系數(shù)表明回歸方程的曲面的開口方向向下，具有極大值點(diǎn)，能夠進(jìn)行最優(yōu)分析。在Y1模型中F值為20.707 65，P= 0.001 924＜0.05，說明此模型顯著。由回歸方程可以看出，3個因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由表4可以看出，依據(jù)F值可知，3個因素對Y1值的影響為X2＞X1＞X3；模型的失擬性檢驗(yàn)擬P=0.327 152＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型的回歸方程對實(shí)驗(yàn)擬合較好，模型能準(zhǔn)確地模擬個因素對CMCase的影響；模型的決定系數(shù)R2=0.973 9，說明該模型能夠很好的擬合97%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

利用SAS9.1軟件，通過所得的回歸方程模型得到響應(yīng)面分析圖和等高線圖如圖1～圖3所示。

當(dāng)固定其中一個因素為0時，響應(yīng)值會隨著其他兩個因素的增大而增大，當(dāng)達(dá)到某一極大值后，繼續(xù)增加，響應(yīng)值反而下降。說明響應(yīng)值Y1有極大值，利用SAS9.1軟件，通過回歸方程得出模型的極大值點(diǎn)，即：X1（氮源）=4.05 g，X2（復(fù)合碳源）=3.69 g，X3（磷酸鹽）=4.68%，CMCase最大酶活為94.868 8 IU/mL。

2.2 最優(yōu)條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

圖1 Y=f（X1，X2）響應(yīng)面分析圖和等高線圖Fig.1 Surface plot and contour plot of Y1 between X1and X2

圖2 Y=f（X1，X3）響應(yīng)面分析圖與等高線圖Fig.2 Surface plot and contour plot of Y1 betweenX1and X3

圖3 Y=f（X2，X3）響應(yīng)面分析圖與等高線圖Fig.3 Surface plot and contour plot of Y1 between X2and X3

按照理論最優(yōu)的外部產(chǎn)酶條件，做3次平行試驗(yàn)，后取平均值得到酶活為92.483 IU/mL與理論值相差不大，說明該模型能較好的擬合97%的實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

由本實(shí)驗(yàn)可以得出響應(yīng)面分析所選取的3個因素：復(fù)合碳源，氮源，磷酸鹽對整個發(fā)酵產(chǎn)酶過程影響顯著，為不可缺少的條件。并且復(fù)合碳源對整個發(fā)酵產(chǎn)酶影響最大，蛋白胨次之，最后為磷酸鹽。通過SAS9.1軟件得出本菌株的最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：X1（氮源）=4.05g，X2（復(fù)合碳源）=3.69g，X3（磷酸鹽）= 4.68%，CMCase最大酶活為94.868 8 IU/mL。

4 討論

從整個優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，復(fù)合碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響最大，這也驗(yàn)證了大多試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果：對于產(chǎn)纖維素酶的菌株，碳源不僅僅作為碳源，更是很好的誘導(dǎo)劑，可以促進(jìn)纖維素酶的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)中磷酸鹽也對發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著影響，這與一般的微生物代謝教科書中的適量的磷酸鹽可以通過促進(jìn)菌體的生長從而促進(jìn)酶量的增加[10]。

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[4]肖舸,雷芳,喻東,等.一株產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].四川大學(xué)學(xué)報,2004(41)：422-425

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[10]楊汝德.現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社,2001：352-356

Optimization of Fermentation Conditions for Cellulase Production of Actinomycetees by Response Surface Analysis

ZENG Bai-quan，XU Zhi，ZHANG Yang-yang
（College of Life of Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China）

Study fermentation conditions，an excellent cellulase-producing strain，which was screened by UV and60Co-γray was researched.The ranges of mixture carbon，peptone，KH2PO4were confirmed through single factor experiment.Carbon and Nitrogen sources and KH2PO4were analysised in response surface by using of SAS9.1 software.The results showed that mixture carbon 3.69 g，Nitrogen 4.05 g，KH2PO44.68%，the max cellulase activity was 94.868 8 IU/mL.

Actinomycetees；cellulase；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.026

2013-04-10

湖南省科技計劃項(xiàng)目（2012NK3113）

曾柏全（1967—），男（漢），副教授，博士，主要從事生物活性物質(zhì)及分子技術(shù)與資源研究。