沈艷婷，林海，陳家平，韓凱寧，楊紅麗，2，*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316004；2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310014）

響應(yīng)面法優(yōu)化攪拌萃取蜂膠總黃酮的提取工藝

沈艷婷1，林海1，陳家平1，韓凱寧1，楊紅麗1，2，*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316004；2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310014）

采用響應(yīng)面法對蜂膠總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以蜂膠原膠為原料，基于單因素實(shí)驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為相應(yīng)因素，蜂膠總黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并對各個(gè)因素的顯著性和交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為提取次數(shù)2次、料液比1∶45（g/mL）、提取時(shí)間30min、乙醇濃度90%，在此條件下，總黃酮的提取率為17.07%。

蜂膠；總黃酮；響應(yīng)面分析法

蜂膠是蜂蜜從外界的膠源植物（如：樺樹、楊樹、柏樹、柳樹等）的嫩芽或樹皮傷口上采集的樹脂，并混入蜜蜂腺體分泌物和蜂蠟而成的一種棕紅色、棕黃色、棕褐色或帶有青綠色的芳香性黏性膠狀固體[1]。目前，從蜂膠中已提取分離出300多種物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)是蜂膠中主要的活性成分[2-4]，具有抗氧化、抗衰老、軟化血管、減少血栓形成及改善人體的微循環(huán)作用，被譽(yù)為珍貴的天然“血管清道夫”[5-7]。

目前，蜂膠中總黃酮的提取已成為研究熱點(diǎn)，付英娟[8]等對超聲波法提取蜂膠黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，王小明[9]則采用微波技術(shù)提取蜂膠中的黃酮，張建和[10]等對冷浸法提取蜂膠總黃酮的方法進(jìn)行了研究，超聲提取和微波提取效率高、耗時(shí)短，但可能會引起活性成分發(fā)生改變[11-12]，使活性降低，而冷浸法耗時(shí)過長，攪拌法可以克服這些問題。本實(shí)驗(yàn)采用磁力攪拌對蜂膠中總黃酮進(jìn)行提取并測定提取液中總黃酮含量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化磁力攪拌提取蜂膠中總黃酮的工藝條件。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與材料

UV-100紫外-可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)；JB-2型恒溫磁力攪拌器：上海雷磁；BSA4124S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器；相關(guān)玻璃儀器。

蜂膠：購自山東泰安；三氯化鋁、醋酸鉀、乙醇均為分析純，蘆?。簢幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥95.0%。

1.2 蘆丁溶液的配制

精密稱取干燥至恒重的無水蘆丁50mg置25mL容量瓶中，加90%乙醇適量使之溶解并定容，搖勻，得蘆丁對照液。精密量取對照液5mL于50mL容量瓶中，用90%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.20 g/L的蘆丁對照品溶液。

1.3 蜂膠中總黃酮的提取

將于-20℃冷凍24 h后的蜂膠原膠快速粉碎，過40目篩備用。準(zhǔn)確稱取0.2 g粉碎后的蜂膠，加適量的乙醇水溶液，進(jìn)行攪拌處理，離心過濾后，添加相同量的乙醇水溶液對濾渣再次攪拌處理，合并2次濾液，定容至50mL，避光保存。

1.4 最大吸收波長的選擇

[13]，分別取樣品溶液和0.20 g/L的蘆丁溶液各1mL，置于50mL容量瓶中，加113.2 g/L三氯化鋁溶液1mL，搖勻，再加9.8 g/L醋酸鉀溶液1mL，搖勻，加14mL 90%乙醇溶液，定容至50mL，用蒸餾水作為空白參照，在200 nm～800 nm掃描吸收曲線。

1.5 總黃酮含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：采用硝酸鋁比色法測定[13]，精密吸取蘆丁對照品使用液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、10.00、12.00mL分別至于50mL容量瓶中。按照1.4的顯色方法進(jìn)行顯色，在最大吸收波長處，以水為空白，測定吸光度，以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.3中的蜂膠提取液稀釋至適宜濃度，以同樣方法測定總黃酮含量。

根據(jù)下式計(jì)算出蜂膠中黃酮的提取率：

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的樣品的黃酮濃度，（mg/mL）；V1為樣品的體積，mL；V2為樣品的總稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量，mg。

1.6 影響提取工藝的因素試驗(yàn)

1.6.1 單因素試驗(yàn)

稱取0.2 g左右的蜂膠粉末，置于錐形瓶中，在不同條件下提取，以確定提取因素變化范圍以及各因素的最佳值。按1.3和1.5中蜂膠中總黃酮的提取及測定方法，測出其吸光度，并折算為提取率。

1.6.2 工藝優(yōu)化試驗(yàn)

以乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)等因素作為考察對象，采用響應(yīng)面分析并設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以獲得最佳的工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇

按照2.4中的方法測量得到蜂膠提取液和蘆丁的在300 nm～520 nm的吸收曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蜂膠提取液的紫外可見吸收光譜Fig.1 The ultraviolet-visible absorption spectrum of the extraction of propolis

由圖1可知，蜂膠黃酮提取液（紫色曲線）和蘆丁對照品溶液（藍(lán)色曲線）均在420 nm的時(shí)候有最大吸收峰，故測量波長選擇為420 nm。

2.2 蘆丁的工作曲線

由1.5中方法可得到圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.027 7x+0.041 4，R2=0.998 9。

圖2 蘆丁的工作曲線Fig.2 The working curve of rutin

2.3 料液比對蜂膠中總黃酮提取率的影響

萃取溫度22℃，提取次數(shù)為3次，乙醇的濃度為90%，提取時(shí)間為30min時(shí)，測定不同料液比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of the liquid-material ratio on flavones extraction rate

由圖3可知，當(dāng)料液比在1∶40（g/mL）的時(shí)候，黃酮的提取率是比較大的，而當(dāng)料液比大于1∶40（g/mL）的時(shí)候，隨著料液比的增加，黃酮的有下降的趨勢，雖然在料液比為1∶100的時(shí)候有所增加，但和1∶40（g/mL）的時(shí)候相差不大，考慮到實(shí)際乙醇用量，料液比選擇在1∶40（g/mL）左右。

2.4 乙醇濃度對蜂膠中總黃酮提取率的影響

萃取溫度22℃，提取次數(shù)為3次，料液比1∶40（g/mL），提取時(shí)間為30min時(shí)，不同乙醇濃度對黃酮提取的影響如圖4所示。

圖4 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on flavones extraction rate

由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度在90%的時(shí)候，黃酮的提取率是最大的，而當(dāng)乙醇的濃度大于90%的時(shí)候，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率有明顯的下降趨勢，所以應(yīng)該選擇乙醇濃度在90%左右比較合適，所以我們選擇了乙醇濃度為90%左右。

2.5 提取時(shí)間對蜂膠中總黃酮提取率的影響

在萃取溫度22℃，乙醇濃度為90%，料液比1∶40（g/mL），提取次數(shù)為3次的條件下，測定不同提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響，如圖5所示。

圖5 提取時(shí)間對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on flavones extraction rate

由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間為30min的時(shí)候，黃酮的提取率最高，而當(dāng)提取時(shí)間大于30min時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮的提取率有所下降，因此選擇提取時(shí)間為30min左右。

2.6 提取次數(shù)對蜂膠中總黃酮提取率的影響

圖6 提取次數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on flavones extraction rate

圖6為萃取溫度22℃，乙醇濃度為90%，料液比1∶40（g/mL）時(shí)，提取次數(shù)對黃酮提取率的影響，由圖可知當(dāng)提取次數(shù)在2次的時(shí)候，黃酮的提取率是最大的，而當(dāng)提取次數(shù)在增加的時(shí)候，隨著提取次數(shù)的增加，黃酮的提取率有明顯的下降趨勢。

2.7 蜂膠總黃酮提取條件的優(yōu)化

2.7.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

根據(jù)中心組合Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)對蜂膠中黃酮提取率影響顯著的4個(gè)因素，采取4因素3水平響應(yīng)面分析方法，根據(jù)二次響應(yīng)面通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)原理，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 蜂膠黃酮提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table1 Variables and levels in response surface design

表2 蜂膠總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Process variables and levels in response surface designarrangement and experimental response values

對料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù)作如下變換注：A=（x1-40）/5；B=（x2-30）/5；C=（x3-90）/5；D=（x4-2）/1，以試驗(yàn)所得黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，其中1～24是析因試驗(yàn)，25～29是中心試驗(yàn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。

對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的響應(yīng)面方差分析結(jié)果顯示，蜂膠黃酮提取反應(yīng)中料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù)4個(gè)反應(yīng)因素的P值分別為0.220 8、0.018 3、0.655 7、0.655 7，其中1個(gè)因數(shù)小于0.05，說明這個(gè)反應(yīng)因素對蜂膠黃酮提取率具有顯著性意義。另外，對各個(gè)反應(yīng)因素之間的交互作用P值A(chǔ)C、AD、CD均大于0.05，說明A與C、A與D、C與D因素之間不存在交互作用（見表3）。

表3 方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance for quadric regression model

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，以蜂膠黃酮提取率為響應(yīng)值，經(jīng)Design-Exper7.1.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，再根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，剔除各因素間不明顯的交互作用得到該試驗(yàn)的回歸方程為：

由表3可知，模型極顯著（P=0.005 0＜0.01），試驗(yàn)所選取的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)在a=0.05的水平上不顯著（P=0.386 3＞0.05），其校正系數(shù)R2=81.16%，因此該模型擬合度較好。綜合以上各參數(shù)表明該試驗(yàn)方法可靠，各因素水平間設(shè)計(jì)合理，因此可用該回歸方程模擬試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

該二次回歸模型的一次項(xiàng)：提取時(shí)間B顯著（P= 0.018 3＜0.05）；交互項(xiàng)：BC極其顯著（P=0.006 6＜0.01）、AB顯著（P=0.038 4＜0.05），BD顯著（P=0.035 0＜0.05）；二次項(xiàng)：D2影響極其顯著（P＜0.01），C2影響顯著（P＜0.05）。各試驗(yàn)因素對蜂膠總黃酮提取率的影響排序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞料液比＞乙醇濃度和提取次數(shù)。

2.7.2 蜂膠總黃酮提取率的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析立體圖以及等高線圖如圖7～圖12所示。

圖7 時(shí)間與料液比對總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of extraction time and liquid-material ratio on flavones extraction rate

圖8 料液比與乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.8 Effect of liquid-material ratio and ethanol concentration on flavones extraction rate

圖9 料液比與提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.9 Effect of liquid-material ratio and extraction times on flavones extraction rate

圖7～圖12直觀的反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。比較6組圖可知：提取時(shí)間對蜂膠的黃酮提取率影響最為顯著，表現(xiàn)為等值線最密；料液比次之，相應(yīng)表現(xiàn)為等值線較密，而提取次數(shù)和乙醇濃度的影響最小不顯著，等值線較寬，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

圖10 提取時(shí)間與乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.10 Effects of extraction time and ethanol concentration on flavones extraction rate

圖11 提取次數(shù)與提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.11 Effects of extraction times and extraction time on flavones extraction rate

圖12 乙醇濃度與提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.12 Effects of ethanol concentration and extraction times on flavones extraction rate

2.7.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對回歸方程求一階偏導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即4個(gè)主要因素的最佳水平值，分別為：A＝0.998，料液比為1：44.99，B＝0.972，提取時(shí)間為34.86min，C＝-0.294，乙醇濃度為88.53%，D＝0.34，提取次數(shù)為2.34次，預(yù)測黃酮的提取率的最大值為17.48%?？紤]到實(shí)際的料液比為1∶45、提取時(shí)間為35min、提取次數(shù)2次及乙醇濃度90%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證最優(yōu)提取條件，采用上述條件進(jìn)行了5組平行試驗(yàn)，結(jié)果黃酮的提取率達(dá)到17.07%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差不到1%。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黃酮的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化蜂膠活性成分黃酮的提取。試驗(yàn)結(jié)果表明：料液比、提取時(shí)間的平方項(xiàng)對黃酮提取率的影響顯著。說明提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度對蜂膠黃酮提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系?；貧w分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法合理可行。得到的最佳提取條件為22.34℃，在乙醇濃度為88.53%，提取時(shí)間34.86min，料液比1∶44.99，提取次數(shù)2.34。實(shí)際條件料液比1∶45提取時(shí)間35min及乙醇濃度90%，提取2次，蜂膠黃酮實(shí)際提取率17.07%。理論預(yù)測值相比相對誤差不到1%，試驗(yàn)結(jié)果良好，說明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化蜂膠黃酮的提取條件是可行的。

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Optimization of Stirring Extraction of Propolis Flavonoids by Response Surface Methodology

SHEN Yan-ting1，LIN Hai1，CHEN Jia-ping1，HAN Kai-ning1，YANG Hong-li1，2，*
（1.Food and Pharmacy School，Medical School，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316004，Zhejiang，China；2.College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，Zhejiang，China）

Propolis flavonoids were extracted by ethanol，and the extraction process was optimized by response surface analysis.On the basis of one-factor-at-a-time experiments，the optimal extraction conditions for maximizing propolis flavonoids were determined by using a 4-variable，3-level Box-Behnken experimental design combined with response surface analysis as follows:the extraction time was 2；the liquid-material ratio was1∶45（g/mL）；the extraction time was 30min；the ethanol concentration was 90%（volume ratio），resulting in anpropolis flavonoids yield of 17.07%.

propolis；flavonoids；response surface methodology（RSM）

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.011

2013-03-25

2013年浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究（分析測試）（項(xiàng)目編號：2013C37067）；2013年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃資助項(xiàng)目（項(xiàng)目號：2013R411036）

沈艷婷（1992—），女（漢），本科，研究方向：藥物分析。

*通信作者