倪孟祥，席煥鴿

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009）

人們?cè)?jīng)認(rèn)為D－氨基酸在生物進(jìn)程中發(fā)揮著相對(duì)較少的作用，并稱之為“非天然氨基酸”。然而近期的研究表明，D－氨基酸在細(xì)胞結(jié)構(gòu)及信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，科學(xué)家們認(rèn)為闡明D－氨基酸如何調(diào)控細(xì)胞壁重塑及生物被膜降解的機(jī)制不僅能夠?qū)?xì)胞質(zhì)外的進(jìn)程有一個(gè)新的理解，并且能夠促進(jìn)新療法的發(fā)展［1］。隨著研究的不斷深入，D－氨基酸在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域的用途被迅速發(fā)掘，如D－氨基酸及其衍生物作為重要的手性原材料被廣泛地應(yīng)用于半合成抗生素、多肽激素、殺蟲劑和甜味劑等的合成中［2－5］。

目前，隨著應(yīng)用的推廣，D－氨基酸的工業(yè)需求量也逐漸增大。D－氨基酸制備方法主要有：對(duì)映體拆分法、化學(xué)合成法和生物法。酶法合成作為生物法中應(yīng)用最多的方法，具有無污染、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)便、成本低、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出很好的商業(yè)前景［6］。在酶法合成D－氨基酸的過程中，D－氨基酰化酶是主要使用的幾種酶之一。迄今已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)D－氨基?；傅奈⑸锇óa(chǎn)堿菌屬、假單胞菌屬、貪噬菌屬、狹長(zhǎng)平胞屬、擬無枝酸菌屬、博德特菌屬、葡萄糖菌屬、甲基桿菌屬、類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈霉菌屬和木霉屬等［7］。其中，來自產(chǎn)堿菌屬的D－氨基?；敢呀?jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［8］。然而，國(guó)內(nèi)對(duì)D－氨基?；傅难芯窟€處于基礎(chǔ)階段，商品酶仍需進(jìn)口。

土壤篩選是獲得產(chǎn)酶微生物的重要途徑。作者從氨基酸類化工廠附近土樣中篩選產(chǎn)D－氨基?；傅木?，并對(duì)活性較高的菌株進(jìn)行了鑒定及培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

土樣采自江蘇省某氨基酸類化工廠排污區(qū)附近。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程有限公司；250bp DNA Ladder Marker，寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA聚合酶，北京康為世紀(jì)有限公司；DNA引物（PAEG純），上海捷瑞公司；其它化學(xué)試劑均為分析純或色譜純。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸膏2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

采用平板稀釋法從土樣中分離菌株。取土壤樣品5g，用無菌生理鹽水逐級(jí)稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5數(shù)量級(jí)，各取0.2mL均勻涂布于分離平板上，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板，30℃倒置培養(yǎng)48h。觀察并挑選生長(zhǎng)快速、菌落較大的菌株劃線純化，純化的菌株斜面置于4℃冰箱保存［9］。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 初篩

將純化的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h。低溫離心收集菌體，菌體用適當(dāng)比例的50mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液（pH值7.8）充分懸浮，加入適量200mmol·L－1的底物N－乙酰－D－甲硫氨酸至濃度為20mmol·L－1，混合均勻，于37℃恒溫水浴振蕩1h，之后立即沸水浴10min終止反應(yīng)。離心后取上清液1μL點(diǎn)樣進(jìn)行蛋氨酸的硅膠薄層層析，展開劑為V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝4∶1∶1。每次需展開劑25mL，另加入1mL 0.5%茚三酮溶液，混合均勻，展開結(jié)束后，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干；顯色斑點(diǎn)與0.05mmol·L－1蛋氨酸的標(biāo)樣斑點(diǎn)比較，檢測(cè)蛋氨酸的含量以反映D－氨基?；傅幕盍?。為了消除所用試劑和菌體本身所含氨基酸對(duì)測(cè)定的干擾，將懸浮后的菌體先煮沸10min，然后加入底物，其余操作同上，作為空白對(duì)照。保留蛋氨酸斑點(diǎn)較大且無雜斑點(diǎn)的菌株進(jìn)行復(fù)篩［10］。

1.3.2.2 復(fù)篩

將初篩保留的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h；采用茚三酮比色法測(cè)定酶活［10］，方法同1.3.2.1。

酶活力單位（U）定義：在pH值7.8、37℃條件下，1min內(nèi)酶催化底物水解釋放出1μmol D－甲硫氨酸為1U。

1.3.3 菌株A55的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)特征觀察及生理生化特征測(cè)定

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）［11］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［12］進(jìn)行試驗(yàn)，鑒定菌種。

1.3.3.2 菌株A55的16SrDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株A55的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性4min；94℃解鏈40s，55℃退火40s，72℃延長(zhǎng)1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延長(zhǎng)10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，純化后交南京思普金公司測(cè)序。將測(cè)序得到的16SrDNA序列通過Blast與GenBank中細(xì)菌及古菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)，利用Mega5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法（neighbor－joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行自舉分析（bootstrap method，1 000次重復(fù)），估算其內(nèi)分支的支持率［13］。

1.3.4 影響D－氨基?；负铣傻囊蛩乜疾?/p>

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝樣量、菌齡、碳源、氮源等對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶活力的影響，優(yōu)化菌株A55的培養(yǎng)條件［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及活性篩選

本實(shí)驗(yàn)以N－乙酰基甲硫氨酸作為分離培養(yǎng)基中的唯一碳氮源。從來自氨基酸類化工廠附近的8份土樣中，分離了約500株菌，并對(duì)其進(jìn)行了D－氨基?；富盍Φ某鹾Y與復(fù)篩，得到了酶活力及穩(wěn)定性均較好的菌株A55，酶活力達(dá)到70U，并對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 菌株A55的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征（表1）

表1 菌株A55的生理生化特征Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of strain A55

菌株A55在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落圓形呈淡黃色，表面濕潤(rùn)，中心凸起，邊緣整齊；在分離固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，菌落點(diǎn)狀呈乳白色，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊。革蘭氏染色陽性，桿狀，鏈狀排列。

2.2.2 16SrDNA序列分析

PCR擴(kuò)增得到的菌株A55的16SrDNA序列全長(zhǎng)為1 416bp，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌及古菌的16SrDNA序列進(jìn)行Blast分析。結(jié)果表明，菌株A55與耐寒短桿菌相似度最高，達(dá)到100%，通過Mega5.2軟件得到了以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

由圖1可知，菌株A55與耐寒短桿菌Brevibacterium frigoritolerans處于同一分支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征可以確定菌株A55為耐寒短桿菌。

2.3 菌株A55發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)條件的確定

圖1 菌株A55的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain A55

溫度及培養(yǎng)基pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)有著非常重要的影響，搖床轉(zhuǎn)速及搖瓶裝樣量主要影響微生物的供氧，也是發(fā)酵中不可忽視的因素?？疾炝伺囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝樣量對(duì)菌株A55生長(zhǎng)及酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)溫度（a）、培養(yǎng)基初始pH值（b）、搖床轉(zhuǎn)速（c）及裝樣量（d）對(duì)菌株A55生長(zhǎng)及酶活力的影響Fig.2 Effects of culture temperature（a），culture initial pH value（b），shaker speed（c）and loaded liquid（d）on biomass and enzyme activity of strain A55

由圖2可知：菌株A55的最佳培養(yǎng)溫度為30℃，在此溫度下，菌體的生長(zhǎng)情況及酶活力均較好；菌株A55在初始pH值為5的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)，其最適初始pH值為7；菌株A55發(fā)酵的最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為200 r·min－1，最佳裝樣量為15%，這與菌株A55嚴(yán)格好氧密切相關(guān)。因此，確定菌株A55適宜的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值7，搖瓶轉(zhuǎn)速200r·min－1，搖瓶裝樣量15%。在此條件下繼續(xù)考察其它因素的影響。

2.3.2 菌齡對(duì)菌株生長(zhǎng)及酶活力的影響

菌株A55所產(chǎn)的D－氨基?；笇儆谡T導(dǎo)酶，只有在培養(yǎng)基中添加N－乙?；被嶙鳛檎T導(dǎo)物時(shí)，菌株才能合成D－氨基?；浮＞闍55的生長(zhǎng)曲線及菌齡對(duì)酶活力的影響見圖3。

圖3 菌株A55的生長(zhǎng)曲線（a）及菌齡對(duì)酶活力的影響（b）Fig.3 Growth curve of strain A55（a）and effect of strain age on enzyme activity（b）

由圖3a可知，由于種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，菌株A55調(diào)整期非常短暫，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在第8h即進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖3b可知，菌株A55在36～60h之間D－氨基酰化酶活力較高，第72h活力明顯降低，可以判斷菌株A55從第60h開始進(jìn)入衰亡期。因此，確定菌株的最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h，酶活力達(dá)到82.99U。

2.3.3 碳、氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及酶活力的影響

分別添加1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，0.5%的硝酸鈉、硫酸銨、尿素、蛋白胨，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，考察不同碳、氮源對(duì)菌株A55的生長(zhǎng)及酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 碳源（a）和氮源（b）對(duì)菌株A55生長(zhǎng)及酶活力的影響Fig.4 Effects of carbon sources（a）and nitrogen sources（b）on biomass and enzyme activity of strain A55

由圖4a可知，在培養(yǎng)基中分別添加不同碳源后，菌株A55的菌體量均明顯增加，葡萄糖的影響尤其突出，菌體量增加至對(duì)照的2.08倍；然而D－氨基?；富盍黠@降低。由圖4b可知，硝酸鈉、硫酸銨及尿素等無機(jī)氮源對(duì)菌株A55的菌體量影響不大，D－氨基?；富盍τ兴档?；相比之下，蛋白胨的添加使菌株A55的菌體量增加至對(duì)照的2.78倍，同時(shí)蛋白胨對(duì)D－氨基酰化酶活力影響也較大，使其降低至對(duì)照的24.67%。表明，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富反而抑制D－氨基?；傅暮铣?，這與該酶屬于誘導(dǎo)酶密切相關(guān)。

3 結(jié)論

從氨基酸類化工廠附近土樣中分離出產(chǎn)D－氨基?；傅木闍55，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測(cè)定及16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定其為短桿菌屬的耐寒短桿菌，具有D－氨基?；富盍Φ哪秃虠U菌此前未見報(bào)道。另外，對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，其最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值7，搖床轉(zhuǎn)速200r·min－1，搖瓶裝樣量15%，培養(yǎng)時(shí)間48h。為實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)D－氨基?；傅纳唐坊懊阜ê铣蒁－氨基酸的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

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