熊澤云，張華新，王洪林，施 紅

（荊楚理工學(xué)院化工與藥學(xué)院，湖北荊門448000）

自20世紀(jì)60年代以來，稀土的許多潛在藥理活性陸續(xù)被證實(shí)［1］，如治療燒傷、抗凝血、抗炎、抑菌、抗動(dòng)脈硬化和抗腫瘤等［2］。雖然稀土藥物前景誘人，但目前對(duì)其在人體內(nèi)作用機(jī)理的研究還比較欠缺，如何有效地利用并盡可能地減輕或避免其毒性或副作用，仍是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，將稀土元素與藥物合成配合物后，一般可提高原藥物的活性，并且可以減輕副作用［3］。蕓香甙是蕓香科植物的活性成分之一，屬維生素類，具有吸收紫外線和X－射線、抗輻射、清除自由基、抗衰老等功效，臨床上用于預(yù)防和治療高血壓、腦溢血、視網(wǎng)膜出血、紫癜和急性出血性腎炎等。

作者在此以蕓香甙為配體合成了鑭（Ⅲ）與蕓香甙的配合物（LaPH），并在模擬人體生理?xiàng)l件下，采用熒光光譜法和圓二色性（circular dichroism，CD）光譜法研究了LaPH與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的作用特征，獲取LaPH與HSA結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、作用力類型、熱力學(xué)性質(zhì)以及LaPH對(duì)HSA分子構(gòu)象的影響等方面的重要信息，為深入了解稀土配合物在人體內(nèi)的吸收、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等代謝過程和毒副作用等奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

HSA工作液：2.0×10－6mol·L－1，美國(guó)Sigma公司。

磷酸鹽緩沖溶液：pH＝7.40，NaCl 0.15mol· L－1。

LS－55型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)PE公司；J－810型圓二色性光譜儀，日本Jasco公司；AY－120型電子分析天平，日本Shimazu公司；SYC－15型恒溫水浴，南京桑力公司。

1.2 方法

1.2.1 鑭（Ⅲ）－蕓香甙配合物的合成

配合物L(fēng)aPH依據(jù)文獻(xiàn)［4］制備，產(chǎn)品（純度＞99%）于硅膠干燥器中保存，使用時(shí)取適量以緩沖溶液溶解、定容。配合物結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 鑭（Ⅲ）－蕓香甙配合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of LaPH

1.2.2 光譜檢測(cè)

不同溫度下，向HSA工作液中加入一定量的LaPH工作液，以緩沖溶液定容，混合均勻后恒溫放置。設(shè)定激發(fā)單色器狹縫寬度15nm、發(fā)射狹縫寬度4 nm、激發(fā)波長(zhǎng)290nm，比色皿厚度1cm，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描HSA－LaPH體系的熒光發(fā)射光譜。室溫下測(cè)定圓二色性光譜，樣品池厚0.1cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 鑭（Ⅲ）－蕓香甙配合物對(duì)HSA的熒光猝滅作用

HSA分子吸收紫外輻射后能產(chǎn)生一定強(qiáng)度的熒光，小分子在與HSA作用的過程中，往往因分子碰撞、生成配合物、能量轉(zhuǎn)移等原因使其熒光強(qiáng)度降低，即產(chǎn)生熒光猝滅。檢測(cè)不同濃度LaPH作用下HSA的熒光發(fā)射光譜，見圖2。

圖2 不同濃度LaPH作用下HSA的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence spectra of HSA in the presence of different concentrations of LaPH

由圖2可知，LaPH對(duì)HSA產(chǎn)生了熒光猝滅作用，且LaPH濃度越高，熒光猝滅作用越強(qiáng)。

2.2 熒光猝滅作用的機(jī)理

熒光猝滅主要分為兩大類，即動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的，其熒光猝滅作用遵循Stern－Volmer方程［5］：

式中：F0、F分別為加入猝滅劑前、后體系的熒光強(qiáng)度；KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，L·mol－1，反映熒光體與猝滅劑在彼此擴(kuò)散和相互碰撞達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)的量效關(guān)系；［Q］為猝滅劑平衡濃度，mol·L－1；Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅的速率常數(shù)，L·mol－1·s－1，反映體系中分子彼此擴(kuò)散和碰撞對(duì)熒光體熒光壽命衰減速率的影響；τ0為無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命。

假設(shè)LaPH對(duì)HSA的熒光猝滅作用是動(dòng)態(tài)猝滅，用方程（1）處理pH值為7.40時(shí)4個(gè)不同溫度下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到Stern－Volmer曲線及方程，見圖3；進(jìn)一步計(jì)算得到動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV，見表1。

圖3 不同溫度下的Stern－Volmer曲線Fig.3 The Stern－Volmer curves at different temperatures

表1 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 Binding constants and thermodynamic parameters at different temperatures

由于動(dòng)態(tài)猝滅是由于分子間的相互碰撞所致，溫度升高將明顯增加分子間有效碰撞數(shù)量，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)升高［6］。但從表1可以看出，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高反而降低了，這說明LaPH對(duì)HSA的熒光猝滅作用不是動(dòng)態(tài)猝滅，而應(yīng)是靜態(tài)猝滅。

靜態(tài)猝滅通常用修正的Stern－Volmer方程（即Lehrer方程）來描述［7］：

圖4 不同溫度下的Lehrer曲線Fig.4 The Lehrer curves at different temperatures

式中：Ka為有效猝滅常數(shù)，也是結(jié)合常數(shù)；fa為熒光體總的熒光強(qiáng)度被猝滅的分?jǐn)?shù)。利用F0／（F0－F）對(duì)［Q］的倒數(shù)作圖，見圖4；由截距1／fa與斜率（faKa）－1求得結(jié)合常數(shù)Ka，見表1。

2.3 結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)

當(dāng)溫度變化不太大時(shí)，可以將焓變?chǔ)θ視為常數(shù)。在等壓條件下，反應(yīng)的焓變?chǔ)θ和熵變?chǔ)θ可以由Van′t Hoff方程求算：

以lnKa對(duì)1／T作圖，進(jìn)而得到Van′t Hoff方程，如圖5所示。

圖5 Van’t Hoff曲線Fig.5 The Van′t Hoff plot

由Van′t Hoff方程求出ΔHθ和ΔSθ后即可由吉布斯－亥姆霍茲方程求得吉布斯自由能ΔGθ：

不同溫度下熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算值見表1。由表1可知：結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)放熱過程；反應(yīng)ΔGθ＜0，表明結(jié)合反應(yīng)能夠自發(fā)進(jìn)行。

2.4 結(jié)合反應(yīng)的作用力類型

有機(jī)小分子藥物與蛋白質(zhì)之間一般為比較弱的相互作用，主要包括靜電引力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等。不同藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合作用力的類型往往也是不同的。Ross等［8］總結(jié)了根據(jù)熱力學(xué)性質(zhì)判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：若ΔH＞0、ΔS＞0，一般是疏水作用力；若ΔH＜0、ΔS＜0，一般是氫鍵和范德華力；若ΔH≈0、ΔS＞0，一般是靜電作用力。由于ΔH＜0、ΔS＜0（表1），推斷LaPH與HSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華力，這可能與配合物L(fēng)aPH的多羥基結(jié)構(gòu)有較大關(guān)系。

2.5 鑭（Ⅲ）－蕓香甙配合物對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的肽鍵在紫外185～240nm處有光吸收，因此在這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有圓二色性。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在240～350nm處有光吸收，當(dāng)它們處于分子不對(duì)稱環(huán)境中時(shí)也表現(xiàn)出圓二色性。圓二色性光譜（CD譜）呈現(xiàn)峰的正性譜線和呈現(xiàn)谷的負(fù)性譜線，可以為有機(jī)化合物的絕對(duì)構(gòu)型、構(gòu)象提供重要信息［9］。在室溫、pH＝7.40的條件下測(cè)定HSA及LaPH－HSA體系［n（LaPH）∶n（HSA）＝5∶1］的CD譜，見圖6；用SELCON3程序處理CD譜的數(shù)據(jù)，計(jì)算出與LaPH作用前后HSA分子中α－螺旋、!－折疊、!－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)的變化情況，見表2。

圖6 HSA和LaPH－HSA體系的圓二色性光譜Fig.6 The CD spectra of HSA and LaPH－HSA

表2 不同二級(jí)結(jié)構(gòu)比例／%Tab.2 Proportions of different secondary structures／%

由表2可知，與LaPH作用后HSA分子中α－螺旋結(jié)構(gòu)減少（60.0%→57.1%），!－折疊（6.0%→7.0%）、!－轉(zhuǎn)角（13.0%→14.4%）、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（21.0%→21.5%）均有所增加。這進(jìn)一步證實(shí)LaPH與HSA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成了新的復(fù)合物，對(duì)HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響［10］。這說明LaPH與蛋白質(zhì)的結(jié)合能有效影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，起到調(diào)節(jié)其生理功能的作用，即LaPH可能具有某些特殊的藥理活性。

3 結(jié)論

在模擬人體生理?xiàng)l件下，LaPH與HSA反應(yīng)生成了新的復(fù)合物，發(fā)生了分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致HSA的熒光猝滅；結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)放熱過程，且能夠自發(fā)進(jìn)行；LaPH與HSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華力；LaPH的結(jié)合使HSA分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，α－螺旋結(jié)構(gòu)減少，!－折疊、!－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加。

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