陳丹丹 彭新潔 李彥紅 王召旭 中國食品藥品檢定研究院 （北京 100050）

生物人工血管是以豬的血管為原料，經過特殊生物處理技術制成，主要用于外科上血管病變的替代和旁路搭橋手術。生物人工血管的結構是內部光滑，不易凝血，且容許內皮細胞爬行覆蓋；外表面呈纖維狀，可供組織粘附爬行，植入部位不易受到感染。

理想的生物材料應具有良好的生物相容性，應對細胞、組織等無毒性、無刺激性、無致畸致突變性。本研究按照GB/T16886 醫(yī)療器械生物學評價的要求對生物人工血管進行了細胞毒性試驗，急性毒性試驗，皮內刺激和致敏試驗，溶血試驗，亞慢性毒性試驗，植入試驗，遺傳毒性試驗，從體內體外兩方面評價生物人工血管的生物相容性[1～6]。

1.材料和方法

1.1 材料

生物人工血管，生產單位：廣州宏暢生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞毒性試驗

取樣品2.0g 加細胞培養(yǎng)液10mL，在37?C 浸提24 小時，取浸提液作為供試液。制備L929 細胞（小鼠成纖維細胞）懸液：消化吹打計數，將細胞濃度調整為1×105·mL-1，吸100μL 細胞懸液注入培養(yǎng)板內，放入含5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時。陽性對照：含20%DMSO的MEM 培養(yǎng)液。陰性對照：高密度聚乙烯。棄去原培養(yǎng)液，每孔分別加入100μL 的空白對照液、陰性對照液、陽性對照液、試驗樣品浸提液，每組設6 孔。24 小時后棄去孔內液體，每孔加入20μL MTT，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 小時后棄去孔內液體，每孔分別加入150μL DMSO，10 分鐘后振蕩，用雙波長（570nm 和630nm）法測定吸光度[7]。

1.2.2 急性毒性試驗

取樣品2.0g 加氯化鈉注射液10mL，在37?C浸提72 小時，取浸提液作為供試液。體重為18-21g 的昆明種小鼠（共10 只，雄性）隨機分為對照組（空白對照液）和實驗組（供試液組）。將浸提液以50ml·kg-1的比例經尾靜脈注射入實驗組體內，將生理鹽水以50ml·kg-1的比例經尾靜脈注射入對照組體內。注射后觀察小白鼠即時反應并于4、24、48 和72 小時觀察和記錄實驗組和對照組動物的一般狀態(tài)、毒性表現和死亡動物數[8]。

1.2.3 皮內刺激試驗

取樣品2.0g 加氯化鈉注射液10ml，在37?C恒溫搖床浸提72 小時，取浸提液作為供試液。將體重為2.0kg～2.2kg 的3 只家兔于試驗前（24 小時）背部去毛備用，在脊柱右側選5 個點注射試驗樣品，每點間隔2cm，同法在左側選5 個點注射氯化鈉注射液（陰性對照），各點注射量為0.2ml。分別在24 小時、48 小時和72 小時內觀察接觸部位的反應情況，按照GB/T16886.10-2005 中的方法判定其結果并記分。

1.2.4 皮膚致敏試驗

取樣品4.0g 加氯化鈉注射液20ml，在37?C恒溫搖床浸提72 小時，取浸提液作為供試液。按照GB/T16886.10-2005 中的方法進行皮內誘導、局部誘導及激發(fā)試驗，判定其結果。

1.2.5 溶血試驗

取樣品1cm×5cm 大小，加入生理鹽水8ml，制備3 份。陰性對照組：生理鹽水10ml，3 管。陽性對照組：蒸餾水10ml，3 管。將各組分別置于37?C 水浴60 分鐘。將水浴后的各樣品管分別加入0.16ml 抗凝兔血，對照管加入0.2 ml 抗凝兔血，再次在37?C 水浴60 分鐘。將水浴后的各管以800g 離心5 分鐘后，吸取上清液。在545nm波長處讀取各管上清液的吸光度值。

1.2.6 亞慢性毒性試驗

體重為230～250 克的SD 品系雄性大鼠30只按體重隨機分為3 組，每組10 只，分別對高劑量組大鼠尾靜脈注射浸提比例為0.4g·ml-1注射劑量為10ml·kg-1的生理鹽水浸提液， 對低劑量組大鼠尾靜脈注射浸提比例為0.2g·ml-1注射劑量為10ml·kg-1的生理鹽水浸提液，對照組給予10ml·kg-1生理鹽水。

給供試品期間密切觀察各組動物的外觀體征、糞便性狀，每日稱體重一次。

連續(xù)給藥14 天后（解剖前夜禁食），10%水合氯醛，0.3ml·100g-1對大鼠腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血，分別測定血液指標：血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞數（RBC）、紅細胞壓積（HCT）、血小板數（PLT）、白細胞數（WBC）、白細胞分類計數（DC）、凝血酶原時間（PT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）和平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）等血液學指標；血液經離心分離血清，測定天門冬氨酸氨基轉換酶（AST）、丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素（UREA）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（T-BIL）、肌酐（CRE）、總膽固醇（T-CHO）、鈣、氯、磷等血清生化學指標。

并于次日處死，系統(tǒng)尸解，稱取心、肝、脾、腎、腎上腺、腦、胸腺、睪丸、附睪的重量并計算臟器系數。肉眼觀察后，將上述組織全部放入中性10%甲醛溶液中固定，石蠟切片、HE 染色、顯微鏡下觀察各臟器的病理組織學變化[9]。

1.2.7 植入試驗

以B 型硬腦(脊)膜補片為對照，將樣品和對照剪成10mm×10mm，選用12 只家兔。體重 2000～2500g。腹腔注射30mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉后， 背部術野剃毛，碘酒，酒精常規(guī)消毒。左，右側脊柱兩側皮下各植入3 個植入物。左側為對照， 右側為樣品。于植入后1 周，4 周，12 周取材進行病理制片，顯微鏡觀察。

1.2.8 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗

取樣品1.8g，加氯化鈉注射液9ml，在37?C 恒溫搖床浸提72 小時，制備浸提液。試驗采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變株(TA97，TA98，TA100 和TA102)。陰性對照為同批號浸提介質生理鹽水(NS);陽性對照為敵克松（500μg·ml-1），2-氨基芴（2mg·ml-1），1,8-二羥基蒽醌（500μg·ml-1）。代謝活化系統(tǒng)：選用健康雄性成年Wistar 大白鼠，采用合并誘導方法制備S9。試驗采用平板摻入法，試驗設陰性對照、陽性對照、浸提液組、1/2 浸提液組、1/4 浸提液組。非活化試驗：加入0.2mol·L-1磷酸緩沖液0.5mL 及受試液、新鮮菌液各0.1mL?；罨囼灒杭尤?%S9mix0.5mL 及受試液、新鮮菌液各0.1mL，置37?C 培養(yǎng)72h 后統(tǒng)計回變菌落數，同時做S9mix檢菌。

1.2.9 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

取樣品4.7g 加入含血清的1640 培養(yǎng)液23.5mL，在37?C 恒溫搖床浸提24 小時，制備浸提液。試驗設陰性對照、陽性對照、浸提液組、1/2 浸提液組、1/4 浸提液組。細胞株采用中華倉鼠肺成纖維細胞(CHL);陰性對照為同批浸提介質，陽性對照為0·25μg·ml-1絲裂霉素(-S9mix)和20μg/mL 環(huán)磷酰胺(+S9mix);代謝活化用多氯聯(lián)苯誘導哺乳動物肝微粒體酶(S9)進行代謝活化。試驗方法采用正常培養(yǎng)的CHL 細胞經消化液作用后，制成5×104個·mL-1細胞懸液，每個細胞培養(yǎng)皿接種3.0mL，培養(yǎng)24h 后吸去培養(yǎng)液，加入測試樣品浸提液?；罨MS9mix作用6h 后換液，培養(yǎng)24h 收獲細胞，非活化組分別于作用24h 和48h 后收獲細胞，制備染色體，Giemsa 染色，顯微鏡下觀察100 個中期分裂相。

1.2.10 哺乳動物細胞體外基因突變試驗

取樣品3.5g 加入含血清的1640 培養(yǎng)液17.5mL，在37?C 恒溫搖床浸提24 小時，制備浸提液。試驗設陰性對照、陽性對照、浸提液組、1/2 浸提液組、1/4 浸提液組。陰性對照為無血清培養(yǎng)液；陽性對照非活化系統(tǒng)為1.0mg·ml-1甲基磺酸乙酯溶液（EMS）， 活化系統(tǒng)為250μg·ml-17,12-二甲基苯蒽（DMBA）。

取純化V79 細胞，每個50mL 大小的培養(yǎng)瓶接種5.0×105個細胞，培養(yǎng)20 小時后，非活化系統(tǒng)分別加入5.0mL 材料浸提液及對照液；活化系統(tǒng)分別加入4.5mL 材料浸提液及對照液后，再加入0.5mL S9 混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。棄去含受試物的培養(yǎng)液，D-Hank?s 洗滌后，換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)20h。上述細胞經消化液消化、計數，將細胞接種于6 孔板中，每孔接種2.0×102個細胞，培養(yǎng)7 天后用甲醇固定，姬姆薩染色，計數形成的集落。另外在50ml 的培養(yǎng)瓶中接種5.0×105個細胞進行表達。中間低密度傳代一次。表達結束后，消化計數，6 孔板的每孔中接種2.0×102個細胞，7 天后測定細胞克隆形成率。同時在6 孔板的孔中接種1.5×105個細胞，2 小時后加入含6-TG 選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，作HGPRT 基因突變集落選擇，選擇期為10 天，計算基因位點突變頻率。

2.結果

2.1 細胞毒性試驗：樣品試驗液的細胞毒性分級按GB/T16886·5 中規(guī)定的分級原則為0 級，陰性對照為1 級，陽性對照為4 級。生物人工血管細胞毒性反應為0 級，符合臨床使用要求。

2.2 急性毒性試驗：按國家標準GB/T16886·11中規(guī)定的標準方法進行，結果小鼠活動正常，未見任何異物反應。在觀察期間動物體重增加和陰性對照相比無任何差異，說明生物人工血管無全身急性毒性反應。

2.3 皮內刺激試驗：家兔脊柱兩側在注射后24h、48h 和72h 觀察注射點，試驗組和陰性對照均為0級，說明生物人工血管無皮內刺激作用。

2.4 致敏試驗：按GB/T16886·11 中規(guī)定的最大劑量法進行試驗，結果陰性對照組和材料試驗組相比無明顯差異，均未觀察到致敏作用。

2.5 溶血試驗：計算溶血率=（OD 樣品–OD 陰性對照）/（OD 陽性對照–OD 陰性對照）=（0.025–0.014）/（0.881–0.014）= 1.2%，符合溶血率不大于5%的標準規(guī)定。

2.6 亞慢性毒性試驗：生物人工血管生理鹽水浸提液（0.4g·ml-1），SD 雄性大鼠尾靜脈注射（10ml·kg-1），連續(xù)給予14 天，結果樣品各劑量組體重增長正常，未發(fā)現臨床征象等一般毒理學指標方面異常，大體和組織病理學檢查，未見各臟器明顯中毒性病理改變。血液學、生物化學相關指標顯示，樣品高劑量組HCT、RBC、HGB、PLT、GLU、UREA、C1 升高，WBC、CRE 降低；低劑量組RBC、HCT、HGB、PLT、GLU、UREA、C1，升高，ALT 降低。凝血酶原時間高低劑量組均高于陰性對照組，其余未見與陰性對照組有統(tǒng)計學差異。

2.7 植入實驗：樣品植入后肉眼觀察所見：各時間點皮膚切口愈合良好，未見局部紅腫及感染。顯微鏡下所見：對照1 周（圖1）：疏松結締組織中，可見一條帶，由紅染的纖維束樣材料組成，呈縱行排列，之間有縫隙，四周可見菲薄的膠原纖維，成纖維細胞，和纖維細胞包繞而成的囊壁。偶見淋巴細胞，另偶見小血管和神經切面(炎I， 纖I-II) 。樣品1 周（圖2）：疏松的脂肪結締組織中可見一紅染束狀植入物，呈縱向排列的細胞網狀，部分致密，部分疏松，邊緣處和四周可見淋巴細胞，吞噬細胞和壞死的細胞碎片，外周可見由成纖維細胞，纖維細胞和膠原纖維構成的囊壁，偶見粒細胞(炎II-III， 纖I-II)。對照4 周（圖3）：疏松的脂肪結締組織中，可見一條帶植入物，由紅染的纖維囊組成，縱行疏松排列，四周可見由成纖維細胞，纖維細胞和菲薄的膠原纖維構成的囊壁。四周偶見淋巴細胞散在分布，囊內材料與囊壁間偶見空隙(炎I， 纖I)。樣品4 周（圖4）：疏松脂肪結締組織中可見一紅染束狀植入物，部分致密，部分疏松，四周可見由成纖維細胞，膠原纖維構成的囊壁，囊壁與周圍疏松結締組織中偶見少許淋巴細胞浸潤(炎I， 纖I)。對照12 周（圖5）：疏松結締組織中，可見一條帶狀植入物，呈紅染束狀，縱行疏松排列，四周可見由膠原纖維和纖維細胞構成的菲薄的囊壁，偶見淋巴細胞在囊周分布(炎I， 纖I）。樣品12 周（圖6）：疏松脂肪結締組織中可見一紅染植入物，呈縱向束帶狀，部分致密，部分疏松，有些切片可見藍色鈣鹽在材料局部沉積，有囊壁形成，由膠原纖維和纖維細胞及脂肪結締組織形成，部分切片可見較多的淋巴細胞灶狀浸潤，四周仍可見小血管和神經切面。（炎癥I，纖維I）。

圖2. 樣品植入后1 周

圖3. 對照植入后4 周

圖4. 樣品植入后4 周

圖5. 對照植入后12 周

圖6. 樣品植入后12 周

對照26 周（圖7）：疏松的結締組織中可見一條狀植入物，為紅染的縱行束狀，排列疏松，四周可見菲薄的纖維膠原構成的囊壁，偶見條帶兩端處囊周有少許淋巴細胞浸潤(炎癥I，纖維I）。樣品26 周（圖8）：疏松脂肪結締組織中，可見一束狀紅染植入物，呈縱向分布，部分顏色變淺，中間未見炎細胞，部分邊緣區(qū)域變疏松，四周可見膠原纖維和纖維細胞包繞形成較厚囊壁，但較疏松，局部區(qū)域有淋巴細胞浸潤，四周結締組織中可見小血管和神經切面（炎癥I，纖維I）。結論：樣品植入后1 周，4 周，12 周，26 周樣品的炎癥反應和纖維囊形成與對照無明顯差別。

2.8 遺傳毒性試驗：單純采用一種試驗方法不能有效評價材料的基因毒性，因此本研究選擇了Ames試驗、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗、哺乳動物細胞體外基因突變試驗綜合評價。結果發(fā)現在活化和非活化條件下，生物人工血管的浸提液、1/2 浸提液、1/4 浸提液對試驗所用4 種菌株的回變菌落數與陰性對照組比較，均未增加2 倍。表明在此實驗條件下，樣品的生理鹽水浸提液對鼠傷寒沙門氏菌無誘變性。在活化和非活化條件下，生物人工血管的浸提液、1/2 浸提液、1/4 浸提液與中國倉鼠肺成纖維細胞（CHL）接觸后，三個劑量浸提液染色體畸變率為0%，與空白對照組無顯著差別，說明生物人工血管無誘導細胞染色體畸變作用。在哺乳動物細胞體外基因突變試驗中，試驗樣品突變頻率未達到或超過陰性對照突變頻率的3 倍，未見試驗樣品突變頻率的增高與劑量相關，未見某一劑量突變頻率的增加有統(tǒng)計學意義。說明在活化和非活化條件下，生物人工血管的各劑量組浸提液對體外培養(yǎng)的V79 細胞無誘導HGPRT 基因突變作用?？傊从^察到生物人工血管的遺傳毒性作用。

圖7. 對照植入后26 周

圖8. 樣品植入后26 周

3.結論

生物人工血管是一種新型的生物材料，通過按國家標準GB/T16886 醫(yī)療器械生物學評價系列標準（等同國際標準ISO10993）進行了全面的生物學評價，證明生物人工血管具有良好的生物相容性，是十分理想的血管替代物，在組織工程方面具有廣闊的發(fā)展空間和應用前景。

[1] GB/T 16886.1 醫(yī)療器械生物學評價 第1 部分：風險管理過程中的評價與試驗

[2] GB/T 16886.3 醫(yī)療器械生物學評價 第3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗

[3] GB/T 16886.5 醫(yī)療器械生物學評價 第5 部分：體外細胞毒性試驗

[4] GB/T 16886.6 醫(yī)療器械生物學評價 第6 部分：植入后局部反應試驗

[5] GB/T 16886.10 醫(yī)療器械生物學評價 第10 部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗

[6] GB/T 16886.11 醫(yī)療器械生物學評價 第11 部分：全身毒性試驗

[7] 鄭琪 ,奚廷斐,陳艷梅等。細菌纖維素的生物相容性研究。藥物分析雜志， 2010, 30 (7)： 1389-1392

[8] 王春仁，姜華，曹宏英等。止血防粘連生物紙的生物相容性研究。中國生物醫(yī)學工程學 報，2007，26，（2）：293～295

[9] 王春仁, 王召旭, 宋誼萍等。止血纖維素材料亞慢性毒性實驗研究。中國藥事，2007 ，21 （9）：695-698