陳卓玥 蔡玉龍 張成 蔡虎 陜西省醫(yī)療器械檢測中心 （西安 710075）

石英晶體微天平技術的發(fā)展始于上世紀60年代初期，1959 年Sauerbrey 發(fā)表論文[1]指出石英諧振器頻率的移動與增加的質(zhì)量成正比例，此發(fā)現(xiàn)被看作是一個突破，邁出了利用一種新的定量方法來測量微量物質(zhì)的第一步，進而提出了石英微天平。QCM-D 現(xiàn)已成為實驗室常見的質(zhì)量感測設備，其靈敏度為0.001mg，比靈敏度是0.1mg 的電子微天平高100 倍，理論上可以測到質(zhì)量變化相當于單分子層或單個原子層的幾分之一。QCM-D 所具有的高靈敏度以及在石英晶體上可實時測量質(zhì)量變化的特點，使它在很多領域的應用上成為一種極具吸引力的技術。1997 年Michael Rodahl 等人[2]應用QCM-D 檢測生物分子的吸附量和細胞的粘附情況。2005 年Hianik 等人[3]將QCM 技術應用于DNA 適配子和凝血酶復合物的檢測研究，獲得了精確的數(shù)據(jù)。近年來有大量的研究報道，QCM 技術應用于人血清白蛋白吸附研究[4]，材料表面結合CD34 抗體的研究[5]，以及定量乳清蛋白吸附的研究[6]均取得了突破性研究進展。采用QCM 技術可獲得高精度的數(shù)據(jù)，使其成為定量檢測蛋白質(zhì)在材料表面吸附研究的熱點。

1. QCM 主要結構和作用

圖1. 石英晶片盒以及用專用鑷子夾起的石英晶片

圖2. (A)整套QCM 檢測設備；(B)四個檢測模塊

圖3. QCM 實驗裝置示意圖

QCM 的主要組成有三個部分：石英晶體傳感器、信號檢測和數(shù)據(jù)處理器。石英晶體振蕩片是從一塊石英晶體上沿著與石英晶體主光軸成+35?15?切割(AT—cut)得到，在它的兩個對應面上涂敷金膜作為金電極，結構見圖1。在每個電極上各焊一根引線接到管腳上，再加上封裝外殼就構成了石英晶體諧振器，其產(chǎn)品一般用金屬外殼封裝，也有用玻璃殼、陶瓷或塑料封裝的。石英晶體微天平的其他組成結構在不同型號和規(guī)格的儀器中也不盡相同，可根據(jù)測量需要選用或聯(lián)用。一般附屬結構還包括振蕩線路、頻率計數(shù)器、計算機系統(tǒng)等；電化學石英晶體微天平在此基礎上還包括恒電位儀、電化學池、輔助電極、參比電極等；另外經(jīng)常加裝一些輔助輸出設備，例如顯示器、打印機等。QCM 試驗裝置實體圖及示意圖分別見圖2 和圖3。

2. QCM 檢測原理

QCM 作為一種感應表面質(zhì)量變化的傳感器，在蛋白質(zhì)吸附的研究方面，已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用。壓電石英晶體生物傳感器主要由用生物識別物質(zhì)包被的壓電石英晶體、振蕩器和頻率計數(shù)器等組成[7]。

壓電石英晶體諧振測量技術是應用壓電效應進行測量的。石英晶體在交變激勵電壓施加于兩側的電極時，會產(chǎn)生機械振蕩。當交變激勵電壓的頻率與石英晶體的固有頻率相同時，振幅變得比一般情況下大得多，形成壓電諧振。一定質(zhì)量的物質(zhì)沉積在石英晶體表面，其振蕩頻率就會發(fā)生相應變化。石英晶體諧振頻率和晶體電極表面質(zhì)量負載變化之間的關系可由Sauerbrey 方程[1]表示：

ΔF = -KF2ΔM/A

公式中 ΔF—晶體吸附外來物質(zhì)后振動頻率的

變化，單位Hz；

K—常數(shù)；A—為被吸附物所覆蓋的

面積，單位m2；

F—壓電晶體的基本頻率，單位MHz；

ΔM—被吸附物質(zhì)的質(zhì)量，單位g 。

由方程可知，ΔF 與ΔM 呈線性關系。此公式僅適用于氣相反應環(huán)境，在液相環(huán)境中粘度、密度、電導率和溶液極性等影響ΔF 與ΔM 的量值關系。1985 年，Bruckenstein 與Kanazawa 等人先后建立了Voigt 黏彈性模型：

Δf = f3/2 (ρη/πρqηq ) 1/2

ρ：溶液的密度；η：溶液的粘度；ρq：純水的密度；ηq：純水的粘度

除鹽溶液和高聚合物溶液外，在其他溶液中晶片的頻率變化Δf 與溶液的(ρη) 1/2 是呈線性變化的[8]，使QCM 得以應用于液相反應環(huán)境中。

化學池里的外來物質(zhì)均勻地附著于電極表面上，引起電極震動頻率的變化，附著物質(zhì)的質(zhì)量變化引起震動頻率相關的變化，從而可以測量到納克級別的質(zhì)量變化[9]。同時電極表面的能量變化可以表示出附著電極表面的物質(zhì)的粘度變化。

3. QCM 檢測方法

3.1 清洗石英晶片

從晶片盒中用專用鑷子取出石英晶片，放入專門用來清洗石英晶片的托子上。用吸管吸取配好的溶液（溶液體積配比為氨水:雙氧水:雙蒸水= 5:1:1）到小燒杯中，吸取溶液的體積到可以浸沒過托子上晶片的程度，將裝了清洗液的小燒杯口用錫箔紙封住，放入75?C 水浴箱中加熱到75?C±2?C。取出小燒杯，將放了晶片的托子放入小燒杯，再放入75?C±2?C 水浴箱中保持15 分鐘。取出托子，用雙蒸水清洗晶片，清洗后自然風干，將石英晶片放入晶片盒中。

3.2 電極預處理

首先配制預處理溶液，用錫箔紙罩住培養(yǎng)皿口，放到恒溫磁力攪拌器上，溫度調(diào)節(jié)為80?C±2?C。待溶液溫度控制到80?C±2?C 后，用專業(yè)鑷子夾取金片放入配好溶液的培養(yǎng)皿中，約10 分鐘，取出金片，將金片放入盛有雙蒸水的培養(yǎng)皿中清洗。

3.3 測定蛋白質(zhì)吸附情況

將預制濃度的蛋白質(zhì)溶液以固定流速（通常為50μl/min）通入檢測模塊，設定通過模塊的溶液溫度（常用溫度為37?C），直到QCM 曲線穩(wěn)定，輔助輸出設備會隨時間變化跟蹤記錄石英晶片震動頻率以及能量的變化，對應為石英晶片表面吸附蛋白質(zhì)質(zhì)量和粘度變化。

3.4 清洗檢測模塊及石英晶片

3.4.1 清洗檢測模塊步驟如下：

（1）用PBS 沖洗，流速適當調(diào)大，沖洗3 到5 分鐘；

（2）用SDS 沖洗；

（3）用雙蒸水沖洗；

（4）抽空；

（5）打開模塊，兩面用吹風機吹干。3.4.2 清洗石英晶片步驟如下：

（1）將氨水水浴加熱到75?C±2?C，晶片放在托子上，放入氨水中浸泡15 分鐘；

（2）SDS 水浴加熱到70?C±2?C，將放有晶片的托子放入，維持15 分鐘；

（3）雙蒸水加熱到70?C±2?C，將晶片放入，浸泡15 分鐘；

（4）取出晶片，自然風干后，放入石英晶片盒中。

4. QCM 技術在蛋白質(zhì)吸附領域的應用

Shons 等人于1972 年首次報道將BSA 固定 于壓電晶體表面用于檢測BSA 抗體。目前QCM 技術已應用于免疫球蛋白、白蛋白、纖維蛋白(原)及降解產(chǎn)物、補體、酶蛋白、甲狀腺素、人絨毛膜促性腺激素及皮質(zhì)醇等檢測[9]。測定抗原/抗體等生物樣品所使用的免疫傳感器可分為無標記（直接測定）型和標記（間接測定）型兩種類型[10]。王珂等人[8]提出，無標記型免疫傳感器通過直接測定抗原抗體復合物形成時的物理、化學變化，極大地簡化制備和操作過程。石英晶體微天平作為無標記型免疫傳感器中的一種，近年來成為應用于抗原/抗體檢測研發(fā)的熱點。QCM 技術應用于蛋白質(zhì)吸附研究具有以下優(yōu)點：

（1）生物樣品無需標記；

（2）能夠實時記錄蛋白質(zhì)在材料表面的吸附行為；

（3）傳感器表面可清洗重復利用；

（4）可在短時間內(nèi)完成蛋白質(zhì)吸附檢測，具有高效性。

近年來，由于臨床診斷、環(huán)境保護、食品和醫(yī)藥等領域發(fā)展的實際需求，在分析過程中越來越多地需要對被分析物進行快速、在線、痕量的分析和監(jiān)測，相信隨著QCM 技術的快速發(fā)展和應用的日趨成熟，其將會更廣泛地應用于微量檢測研究領域。

[1] Sauerbrey G Z. Use of quartz vibration for weighing thin films on a microbalance[J]. J. Physik, 1959, 155: 206-212.

[2] Rodahl M, H??k F, Fredriksson C, et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion[J]. Faraday Discussions, 1997, 107: 229-246.

[3] Hianik T, Ostatná V, Zajacová Z, et al. Detection of aptamer–protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2005, 15(2): 291-295.

[4] Indest T, Laine J, Kleinschek K S, et al. Adsorption of human serum albumin (HSA) on modified PET films monitored by QCM-D, XPS and AFM[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2010, 360(1): 210-219.

[5] Lin Q, Ding X, Qiu F, et al. In situ endothelialization of intravascular stents coated with an anti-CD34 antibody functionalized heparin–collagen multilayer[J]. Biomaterials, 2010, 31(14): 4017-4025.

[6] Liu SX, Kim JT. Application of Kevin–Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Journal of the Association for Laboratory Automation. 2009. 14(4): 213-220.

[7] 陳秀美. 注流式液相壓電物物感測晶片開發(fā)與應用. Chemistry (The Chinese Chem. Soc., Taipe1). 2001, 59(6):253-256.

[8] 王珂, 江德臣, 劉寶紅, 張松, 呂太平, 孔繼烈. 無標記型免疫傳感器的原理及其應用. 分析化學. 2005, 33.

[9] 王惠民. 石英晶體微天平技術及在醫(yī)學中的應用. 南通大學學報: 醫(yī)學版. 2006, 25(5):393-394.

[10] Skladal P. Electroanal. , 1997, 9 (10) : 737～745