鄭樂，張頤，郭科軍

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110001）

KLF10、Smad7與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展關系的研究

鄭樂，張頤，郭科軍

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110001）

Correlation Study between KLF10，Smad7 Expression and the DevelopmentofEpithelialOvarian Cancer

應用免疫組化S-P法染色檢測60例上皮性卵巢癌、15例交界性卵巢腫瘤、30例上皮性良性卵巢腫瘤、10例正常卵巢組織的石蠟切片中Krüpple樣因子10（KLF10）及母系DPP同源物（Smad7）的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)與正常卵巢組織及卵巢良性組織中的表達比較，KLF10在上皮性卵巢癌中低表達，Smad7在上皮性卵巢癌中高表達；KLF10、Smad7與上皮性卵巢癌病理分級、臨床分期有關，2者在上皮性卵巢癌中表達呈負相關（r=-0.303，P=0.018）。因此認為KLF10和Smad7與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關。

上皮性卵巢腫瘤；Krüpple樣因子10；母系DPP同源物

卵巢癌在女性生殖器官腫瘤中的發(fā)生率占第三位，但死亡率居第一位。由于卵巢居盆腔深處，一旦發(fā)生惡性腫瘤，癥狀十分隱蔽，當患者出現(xiàn)不適就診時，絕大多數(shù)病變已進入晚期，腫瘤已發(fā)生轉移，手術及化療的效果不佳。

Krüpple是果蠅分節(jié)基因“間隙基因”類的一個成員，它因編碼包含1個DNA結合序列的蛋白質，一群與Krüpple的鋅指結構高度同源的蛋白質被發(fā)現(xiàn)，命名為Krüpple樣因子（Krüpple-like factor，KLFs），它們是參與廣泛的細胞進程的轉錄調節(jié)蛋白。Krüpple樣因子10（Krüpple-like factor 10，KLF10）在轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）介導的細胞生長控制和分化中發(fā)揮著重要作用。TGF-β結合到其跨膜受體激酶來起始獨特的細胞內信號級聯(lián)，包括Smads信號、轉錄因子以及獨立于Smads的信號途徑。TGF-β在不同的條件下對不同類型的細胞產生不同的生物學作用：誘導上皮細胞凋亡，抑制免疫功能，調節(jié)細胞的生長分化，刺激間質細胞增殖，產生細胞外基質，誘導體內各種組織纖維化反應等［1］。Smad7是TGF-β信號傳導通路的抑制型Smad，可通過阻止Smad2、Smad3的磷酸化和Smad2、3、4異源復合物的形成，從而阻斷TGF-β信號在胞質內的傳導［2］，KLF10在正常的上皮細胞通過終止Smad7加強的負反饋回路來強化Smad的信號活性，誘導細胞凋亡［3］。有研究表明［4］，在胰腺癌細胞中，KLF10的表達水平低于正常胰腺組織，提示其在腫瘤生成中具有重要作用。本實驗通過檢測上皮性卵巢癌中KLF10及Smad7的表達，旨在明確KLF10、Smad7在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及2者相關性，從而為卵巢癌的生物治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源：本實驗石蠟標本取自2005年1月至2011年1月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科住院行手術治療，術前未行化療和放療，術后均經病理檢查確診的患者（全部患者均知情同意并經中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準）。甲醛固定石蠟包埋的組織切片常規(guī)進行HE染色，分別由2名病理診斷醫(yī)師確定腫瘤的病理類型以及組織學分級。包括正常卵巢組織10例、上皮性卵巢良性腫瘤30例（漿液性囊腺瘤20例，黏液性囊腺瘤10例），上皮性卵巢交界性腫瘤15例（漿液性交界性腫瘤8例，黏液性交界性腫瘤7例），上皮性卵巢癌60例（漿液性囊腺癌32例，黏液性囊腺癌18例，子宮內膜樣癌10例）。60例上皮性卵巢癌中，中位年齡45歲；按組織分化程度分為：高-中分化40例，低分化20例；采用國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）2009年制定的分期標準，臨床分期：Ⅰ期+Ⅱ期30例，Ⅲ期+Ⅳ期30例。

1.1.2 主要試劑：濃縮型兔抗人KLF10多克隆抗體（工作濃度1∶100）購自Bioss公司；濃縮型兔抗人Smad7多克隆抗體（工作濃度1∶100）購自Bioss公司；S-P免疫組化試劑盒及DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

組織蠟塊行4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化S-P法。

1.3 結果判定

KLF10、Smad7陽性表達主要位于細胞質，呈棕黃色顆粒分布。在200倍顯微鏡下觀察每張切片，隨機選定10個視野，每個視野通過彩色CCD攝像機將圖像輸入計算機病理圖像分析系統(tǒng)MPIAS2000，將陽性細胞的染色強度轉變?yōu)榱炕笜?，計算積分光密度（integral optical density，IOD）值，用表示，取圖像測量結果的平均值，定量分析蛋白表達。

同時結合傳統(tǒng)的免疫組化分析方法打分對結果進行進一步驗證：KLF10、Smad7以腫瘤細胞胞質和（或）細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判定標準。隨機選擇10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。按染色強弱及陽性細胞數(shù)兩個方面來計算評分。a：染色強度（不著色0分，淺棕色1分，棕黃色2分，棕褐色3分）；b：陽性細胞數(shù)（無陽性細胞0分，陽性細胞數(shù)＜25%1分，陽性細胞數(shù)25%～50%2分，陽性細胞數(shù)＞50%3分），計算a+b的值即為得分，得分≤1分為（-），2～3分為（+），4～5分（++），＞5分為（+++），本組實驗結果陽性是指（+～+++）。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 KLF10、Smad7的表達

KLF10、Smad7陽性表達主要位于細胞質，呈棕黃色顆粒分布，見圖1～4。KLF10在上性卵巢癌中的表達低于在正常卵巢組織及卵巢良性組織中的表達，Smad7在上皮性卵巢癌中的表達水平高于在正常卵巢組織及卵巢良性組織中的表達，各實驗組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 KLF10、Smad7與病理分級的關系

KLF10在上皮性卵巢癌高-中分化組中的表達水平高于低分化組中的表達水平，Smad7在上皮性卵巢癌高-中分化組中的表達水平低于低分化組中的表達水平，2者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 KLF10、Smad7與臨床分期的關系

KLF10在上皮性卵巢癌Ⅰ+Ⅱ期組中的表達水平高于Ⅲ+Ⅳ期組中的表達水平，Smad7在上皮性卵巢癌Ⅰ+Ⅱ期組中的表達水平低于Ⅲ+Ⅳ期組中的表達水平，2者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

2.4 KLF10、Smad7在上皮性卵巢癌中表達的相關性

經Spearman相關分析顯示KLF10與Smad7陽性表達呈負相關（r=-0.303，P=0.018）。

圖1 KLF10在卵巢癌中的陰性表達SP×200

圖2 KLF10在正常卵巢組織中的陽性表達SP×200

圖3 Smad7在正常卵巢組織中的陰性表達SP×200

圖4 Smad7在卵巢癌中的陽性表達SP×200

表1 KLF10、Smad7在各組的表達比較

表2 KLF10、Smad7在不同病理分級中的表達

表3 KLF10、Smad7在不同臨床分期中的表達

3 討論

國內外研究顯示，作為轉錄調控因子的一種，Krüpple樣C2H2型鋅指蛋白參與細胞的生長、增殖、分化的基因調控，在胚胎發(fā)育及許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都起著重要的作用。到目前為止，至少發(fā)現(xiàn)20種KLFs，它們通過調控多種富含GC或CACCC的啟動子的基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等多種生理、病理過程［3］。

TGF-β是一類具有多種生物學活性的多肽生長因子，TGF-β在正常細胞中，通過阻斷細胞從G1期進入S期而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，TGF-β可延續(xù)其基態(tài)下的促凋亡功能，抑制腫瘤細胞增殖。李瑩瑩等［5］研究表明，TGF-β1能抑制人子宮內膜癌Ishikawa細胞的增殖，促進細胞凋亡，阻滯細胞周期。余星平等［6］通過檢測Smad7在子宮頸癌組織中表達，結果顯示Smad7的陽性率明顯高于對照組（P＜0.05），同時Smad7的表達與子宮頸癌的臨床分期及淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。本組實驗通過檢測Smad7在各實驗組中的表達水平，Smad7在分化成熟，處于非增殖期的上皮性卵巢細胞中表達較弱。說明Smad7作為轉化生長因子β信號傳導通路的抑制型Smad，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。

KLF10在TGF-β介導的細胞生長控制和分化中發(fā)揮著重要作用。作為抑癌基因［7］，KLF10在正常的上皮細胞通過終止Smad7加強的負反饋回路來強化Smad的信號活性，誘導細胞凋亡［3］。KLF家族的幾個成員包括KLF4［8］、KLF5［9］、KLF6［10］、KLF8、KLF9［11］、KLF10［3］、KLF11［12］參與多種癌癥的病理過程，有研究顯示：KLF4作為一種抑癌基因，其表達的缺失會促進細胞的增殖，在結腸腺瘤和結腸癌的組織里KLF4mRNA水平相對正常組織是顯著減少的［8］；KLF5在前列腺癌、乳腺癌中表達缺失［9，13］。馮潔等［10］研究表明KLF6、SP1蛋白在肝癌組織表達率高于癌旁肝硬化組織，正常組織中全部呈陰性表達，癌組織中KLF6的高表達可能是在癌癥形成過程中被激活而發(fā)生的代償作用。

本組實驗KLF10在上皮性卵巢癌中低表達，正常卵巢組織中高表達，且卵巢癌組與其他各組差異有統(tǒng)計學意義。提示KLF10在分化不成熟，處于增殖期的上皮性卵巢細胞中表達較弱，作為一種抑癌基因，可誘導細胞凋亡。實驗結果中出現(xiàn)的KLF10、Smad7在正常卵巢組織及上皮性卵巢良性腫瘤中的表達水平差異有統(tǒng)計學意義，可能由于Smad7、KLF10是在上皮性卵巢腫瘤中早期出現(xiàn)的、快速的、選擇性上調或下調的基因。KLF10和Smad7在上皮性卵巢癌中表達與腫瘤病理分級、臨床分期有關。KLF10、Smad7可能在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

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（編輯武玉欣）

R737.31

A

0258-4646（2014）03-0277-03

鄭樂（1987-），女，博士研究生.

郭科軍，E-mail：guokejuncmu@163.com

2013-12-04

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