吳翊馨，蘇勝林，張海平，單德紅

（1.沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院生理教研室，沈陽110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)，沈陽110847）

抑郁模型大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖的研究

吳翊馨1，蘇勝林1，張海平1，單德紅2

（1.沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院生理教研室，沈陽110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)，沈陽110847）

目的評(píng)價(jià)抑郁狀態(tài)下海馬神經(jīng)再生能力。方法20只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和抑郁癥模型組（模型組），復(fù)制慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型。觀察大鼠體質(zhì)量和行為學(xué)變化，放免法檢測血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT）水平，光鏡及電鏡技術(shù)觀察海馬CA3神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測海馬齒狀回巢蛋白（Nestin）及其mRNA表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量及其增長率下降，行為學(xué)得分減少，血漿CRH、ACTH和CORT顯著升高，海馬CA3神經(jīng)元出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，海馬Nestin及其mRNA表達(dá)增加。結(jié)論抑郁狀態(tài)下海馬神經(jīng)再生能力上升。

抑郁癥；海馬；神經(jīng)再生；慢性應(yīng)激；巢蛋白

目前認(rèn)為，抑郁癥主要是由于長期負(fù)性情緒和不良生活處境等慢性應(yīng)激刺激引起，近70%患者存在由于下丘腦-腺垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamicpituitary-adrenal axis，HPA）軸功能亢進(jìn)所引起的海馬損傷現(xiàn)象［1］，因此對(duì)抗慢性應(yīng)激、保護(hù)或修復(fù)海馬受損神經(jīng)元就成為抗抑郁的一個(gè)重要策略。在海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞層下區(qū)存在相當(dāng)數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞，在適宜環(huán)境中能夠發(fā)育成神經(jīng)元，這就使修復(fù)海馬受損功能成為可能［2］，但抑郁狀態(tài)下這種現(xiàn)象呈現(xiàn)何種變化，目前尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)主要通過復(fù)制大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型，觀察抑郁狀態(tài)下海馬的神經(jīng)再生狀態(tài)，為從神經(jīng)再生方面開展抗抑郁工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

20只雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和抑郁癥模型組（模型組），室溫20～24℃，濕度40%～40%，光照時(shí)間12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 抑郁癥模型的建立

模型組大鼠參考文獻(xiàn)［3］的方法，復(fù)制慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型，即大鼠單籠飼養(yǎng)，在21 d內(nèi)接受各種未預(yù)知刺激，包括束縛1 h，禁食24 h，禁水24 h，4℃冷水游泳4 min，44℃烘箱熱烘4 min，夾尾1 min，電擊足底2 min（電壓為30 V，4 s，間歇4 s），共7種刺激，21 d內(nèi)每日隨機(jī)給予1種，每種刺激在實(shí)驗(yàn)全程中施加3次。

1.3 大鼠體質(zhì)量、行為學(xué)檢測

于建模前、后檢測。行為學(xué)檢測采用曠場實(shí)驗(yàn)法，利用泰盟TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察其運(yùn)動(dòng)軌跡及3 min內(nèi)水平運(yùn)動(dòng)和垂直活動(dòng)得分。

1.4 血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）水平的檢測

采用放免法檢測。在第21天，大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.4 mL/100 g）麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，注入含肝素鈉的試管中，離心后取血漿，低溫冷藏，按試劑盒說明書操作檢測。

1.5 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

［4］的方法取海馬，其中部分用于光鏡，部分用于電鏡，觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。

1.6 Nestin及其mRNA表達(dá)

參考文獻(xiàn)［4］的方法，利用免疫組化方法檢測Nestin表達(dá)，染色對(duì)照用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗孵育，原位雜交技術(shù)檢測NestinmRNA表達(dá)，陰性對(duì)照用0.4 mol/L的PBS代替一抗。利用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化

建模前2組大鼠的體質(zhì)量無明顯差異，建模后模型組大鼠的體質(zhì)量及其增長率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量和行為學(xué)得分變化Tab.1 Changes of body mass and behavior scores of rats

2.2 大鼠行為學(xué)變化

對(duì)照組大鼠進(jìn)入檢測箱后，均迅速離開中心區(qū)域，在箱體四周進(jìn)行搜索，其水平和垂直活動(dòng)得分較高（圖1A，表1）。模型組大鼠進(jìn)入檢測箱后，雖然也是沿四周進(jìn)行搜索，經(jīng)常通過中心區(qū)域，其水平和垂直活動(dòng)得分均顯著低于對(duì)照組（圖1B，表1）。

圖1 典型大鼠活動(dòng)軌跡Fig.1 Typical motion tracks of rats

2.3 大鼠血漿CRH、ACTH和CORT水平

模型組大鼠的CRH、ACTH和CORT水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。見表2。

2.4 大鼠海馬CA3神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化

光鏡下，對(duì)照組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元排列整齊，層次豐富（圖2A），而模型組則層次減少，大量細(xì)胞壞死（圖2B）。電鏡下，對(duì)照組神經(jīng)元的細(xì)胞器正常，細(xì)胞核呈圓形，核膜清晰完整，染色質(zhì)分布均勻（圖2C）；模型組大鼠神經(jīng)元的細(xì)胞器減少，線粒體空泡化，細(xì)胞核變小，不規(guī)則，核膜增厚（圖2D）。

2.5 大鼠海馬Nestin及其mRNA表達(dá)

Nestin免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色，模型組鏡下陽性反應(yīng)物較多，邊緣清楚（圖3）。模型組和對(duì)照組Nestin平均光密度值分別為74.36±28.43和44.28±17.04，NestinmRNA表達(dá)水平分別為41.84± 21.46和32.61±14.90，模型組Nestin及其mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組（均P＜0.01）。

3 討論

海馬神經(jīng)元損傷是抑郁癥的常見病理變化，主要與慢性應(yīng)激有關(guān)，如工作學(xué)習(xí)壓力大、生活節(jié)奏過快等，相似的結(jié)果也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［6，7］。海馬神經(jīng)再生現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為修復(fù)海馬功能提供了研究方向，但慢性應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)再生的影響目前還不甚清楚。

表2 大鼠CRH、ACTH和CORT水平Tab.2 CRH，ACTH and CORT levels of rats

圖2 光鏡和電鏡下觀察2組大鼠CA3神經(jīng)元Fig.2 Observation of CA3 neurons in the rats of 2 groups

圖3 2組大鼠Nestin表達(dá)×400Fig.3 Nestin expression in the rats of 2 groups×400

3.1 抑郁癥模型大鼠的整體表現(xiàn)

為開展相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)首先建立了大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型。相關(guān)檢測結(jié)果顯著，經(jīng)過21 d的慢性應(yīng)激刺激，模型組大鼠的體質(zhì)量及其增長率、行為學(xué)得分均顯著低于對(duì)照組。首先，體質(zhì)量及其增長率顯著下降，反映了大鼠的營養(yǎng)狀態(tài)下降，這主要是大鼠飲食減少的結(jié)果，與抑郁癥患者出現(xiàn)的食欲下降、體質(zhì)量降低相似；其次，模型組大鼠在箱體中搜索時(shí)過多通過中心強(qiáng)光區(qū)域，且水平和垂直活動(dòng)得分也明顯降低，提示經(jīng)過慢性應(yīng)激刺激，模型組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、對(duì)外界事物關(guān)注度降低和探索行為減少等癥狀，這與抑郁癥患者極為相似。這些現(xiàn)象提示，模型組大鼠已出現(xiàn)了人類抑郁癥的相關(guān)表現(xiàn)，可以以此為載體開展相關(guān)研究。

3.2 抑郁癥HPA軸亢進(jìn)與海馬神經(jīng)元損傷

HPA軸是人體重要的內(nèi)分泌軸，由下丘腦、腺垂體和腎上腺皮質(zhì)分別釋放的CRH、ACTH和糖皮質(zhì)激素組成，在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。HPA軸功能亢進(jìn)是抑郁癥的突出特征，患者常出現(xiàn)CRH分泌亢進(jìn)、ACTH基礎(chǔ)分泌過高和腎上腺皮質(zhì)對(duì)ACTH反應(yīng)過高等現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的CRH、ACTH和CORT均高于對(duì)照組，說明在慢性應(yīng)激刺激下，大鼠的HPA軸處于亢進(jìn)狀態(tài)，這與文獻(xiàn)結(jié)果相同［8］。

慢性應(yīng)激會(huì)持續(xù)興奮HPA軸，繼而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元過度興奮而出現(xiàn)損傷。本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組出現(xiàn)HPA軸亢進(jìn)的同時(shí)，其海馬CA3區(qū)出現(xiàn)了細(xì)胞層次減少、細(xì)胞大量壞死和細(xì)胞器減少、線粒體破壞、細(xì)胞核異常等變化，與相關(guān)報(bào)道相似［4］。由于海馬功能涉及了情緒產(chǎn)生、學(xué)習(xí)記憶和內(nèi)臟功能調(diào)節(jié)等眾多方面，因此其結(jié)構(gòu)損傷必然導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列異常。

3.3 抗抑郁與海馬齒狀回神經(jīng)再生

現(xiàn)代社會(huì)的工作壓力大、生活節(jié)奏快，為了生存人們難以擺脫這種社會(huì)應(yīng)激，因此抑郁癥發(fā)病率急劇升高。而確診為抑郁癥后，又因?yàn)楣ぷ骱蜕顗毫﹄y以完成系統(tǒng)治療，造成抑郁癥反復(fù)發(fā)作，海馬損傷日漸加重。研究發(fā)現(xiàn)，海馬損傷程度與抑郁癥的病變程度呈正相關(guān)［9］。因此，修復(fù)海馬就成為抗抑郁的重要環(huán)節(jié)。

成年哺乳動(dòng)物海馬的齒狀回處存在神經(jīng)干細(xì)胞，能夠增殖分化生成新的神經(jīng)元，遷移至顆粒細(xì)胞層，與CA3區(qū)神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系。這就使修復(fù)受損傷的海馬功能成為可能，但抑郁狀態(tài)下這種現(xiàn)象是否仍然存在、程度如何，目前尚不十分清楚。

本實(shí)驗(yàn)以Nestin及其mRNA為指標(biāo)，對(duì)海馬的再生能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠齒狀回處有少量Nestin及其mRNA表達(dá)，提示生理狀態(tài)下大鼠海馬存在神經(jīng)再生，但并不顯著；而模型組齒狀回處的Nestin及其mRNA表達(dá)均顯著上升，結(jié)果與相關(guān)報(bào)道類似［4，10］，說明抑郁狀態(tài)下海馬的再生能力增強(qiáng)，提示海馬仍然具備相當(dāng)?shù)淖晕倚迯?fù)能力，這就為通過促進(jìn)海馬神經(jīng)再生來抗抑郁帶來了希望。不過值得提出的是，Nestin及其mRNA表達(dá)增加，并不表示海馬的神經(jīng)干細(xì)胞最終能夠發(fā)育成所需的神經(jīng)元，這中間還需要適當(dāng)?shù)膬?nèi)環(huán)境因素誘導(dǎo)。而抑郁狀態(tài)下，海馬神經(jīng)再生的內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)了何種變化、如何利用、從而為抗抑郁服務(wù)，還存在許多未知，需要在以后的工作中進(jìn)行深入研究。

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（編輯 陳姜）

Proliferation Study of HippocampalNeuralStem Cellsin Dentate Gyrusof Depressed ModelRats

WUYi-xin1，SU Sheng-lin1，ZHANGHai-ping1，SHAN De-hong2
（1.Physiology Teaching and Research Section，Institute of Human Movement Science，Shenyang Sport University，Shenyang 110032，China；2.Combination of Chinese and Western Based Professional，Liaoning University ofTraditionalChinese Medicine，Shenyang 110847，China）

ObjectiveTo evaluate the hippocampal neurogenesis in depression.MethodsA total of 20 Wistar rats were randomly divided into control and depression group（model group）.Chronic unpredicted stress model was established.Body mass weigh and behavioral scores of the rats were observed.Radioimmunoassay was used to measure plasma concentrations of corticotropin releasing hormone，adrenocorticotropic hormone and cortisone.Light and electron microscope were used to detect the morphological change of hippocampal CA3 neurons.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detectboth protein and mRNA expressions ofNestin in hippocampaldentate gyrus.ResultsCompared with the control group，rats in the model group，both body mass weigh and the related increase rate were markedly decreased，and the behavioral scores were reduced significantly.In addition，neuraldamage wasobserved in hippocampalCA3 neurons，and the Nestin expressions in hippocampaldentate gyrus were evidently increased.ConclusionHippocampalneurogenesis was increased in depression.

depression；hippocampal；neurogenesis；chronic stress；Nestin

R363

A

0248-4646（2014）04-0347-04

吳翊馨（1973-），女，副教授，博士研究生. E-mail：yixin0414@163.com

2013-10-29

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