汪穎厚，陳安杰，王斌，楊棟，辛世杰，蔡相軍

（1.中國(guó)人民解放軍第202醫(yī)院普通外科，沈陽(yáng)110812；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管甲狀腺外科，沈陽(yáng)110001）

RHOA/ROCK-2信號(hào)通路在甲狀腺髓樣癌中的表達(dá)及意義

汪穎厚1，陳安杰1，王斌1，楊棟2，辛世杰2，蔡相軍1

（1.中國(guó)人民解放軍第202醫(yī)院普通外科，沈陽(yáng)110812；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管甲狀腺外科，沈陽(yáng)110001）

Expression of RHOA/ROCK-2 Signaling Pathway in Medullary Thyroid Carcinoma and Its ClinicalSignificance

采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)RHOA、ROCK-2蛋白在甲狀腺髓樣癌（MTC）組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：MTC中RHOA、ROCK-2蛋白表達(dá)水平較癌旁甲狀腺組織中明顯增高，二者的表達(dá)與患者的性別、年齡及TNM分期無關(guān)，而ROCK-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。RHOA、ROCK-2的表達(dá)可能對(duì)MTC的發(fā)生和發(fā)展有重要作用。

甲狀腺髓樣癌；RHOA；ROCK-2；轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)

甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）是甲狀腺癌中比較少見的類型，約占所有甲狀腺惡性腫瘤的4%～10%［1］，屬中度惡性甲狀腺癌。MTC具有多灶性的特點(diǎn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)較早，且有遺傳傾向，預(yù)后一般［2］。近年來甲狀腺癌發(fā)病率迅速增加，MTC的發(fā)病率也隨之升高［3］，但導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制目前尚未明確。研究表明，RET和RAS原癌基因突變可導(dǎo)致甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞內(nèi)外區(qū)蛋白構(gòu)象的改變，誘導(dǎo)細(xì)胞增生過度而發(fā)生惡變，引發(fā)MTC［4］。而細(xì)胞的惡性增殖與多種信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān)。RHOA/ROCK-2信號(hào)通路受多種上游因子的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)其下游NFκB的轉(zhuǎn)錄活性，在眾多生理及病理過程中發(fā)揮作用，尤其在細(xì)胞的增殖、骨架重排、遷移和代謝以及血管重塑等方面起著關(guān)鍵作用［4，6］。實(shí)驗(yàn)證明，RHOA、ROCK-2蛋白在多種惡性腫瘤中存在過表達(dá)，并在其發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程中起重要作用［7］。然而，RHOA/ROCK-2在MTC中的表達(dá)及作用目前鮮有報(bào)道。本研究擬檢測(cè)RHOA、ROCK-2蛋白在MTC中的表達(dá)水平，旨在探討RHOA/ROCK-2信號(hào)通路是否與MTC的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源及一般資料：收集中國(guó)人民解放軍第202醫(yī)院及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2008年至2012年術(shù)后病理確診為MTC的石蠟樣本30例，包括癌組織及癌旁組織。30例石蠟樣本中，男14例，女14例；年齡24～74歲，中位年齡47歲。依據(jù)2013年NCCN標(biāo)準(zhǔn)臨床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期11例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例。

1.1.2 主要試劑：RHOA、ROCK-2多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）均為大鼠抗人抗體，兔抗大鼠二抗（北京中杉金橋公司）；SP法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液（福州邁新公司）。

1.2 方法

組織形態(tài)學(xué)檢查：取標(biāo)本中段做4 μm切片，行HE染色及免疫組織化學(xué)染色（RHOA抗體稀釋比例為1∶100，ROCK-2抗體稀釋比例為1∶400）。奧林巴斯AX70U、BX61+DP71成像系統(tǒng)采集圖像，在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，以無陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為陰性（-），陽(yáng)性細(xì)胞≥10%為陽(yáng)性（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)檢查結(jié)果

30例MTC及癌旁組織中，RHOA在MTC組織中呈陽(yáng)性表達(dá)27例，陽(yáng)性表達(dá)率90.00%（27/30），ROCK-2在MTC組織中呈陽(yáng)性表達(dá)24例，陽(yáng)性表達(dá)率83.33%（24/30）；癌旁甲狀腺組織中無RHOA陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為0（0/30），癌旁甲狀腺組織中ROCK-2陽(yáng)性表達(dá)1例，陽(yáng)性表達(dá)率3.33%（1/30）（圖1）。RHOA、ROCK-2在MTC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 RHOA、ROCK-2的表達(dá)與MTC臨床病理特征的關(guān)系

如表2所示：RHOA、ROCK-2的表達(dá)均與患者的性別、年齡及TNM分期無關(guān)，而ROCK-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.04）。

3 討論

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，而MTC較少見，其惡性程度明顯高于甲狀腺乳頭狀腺癌（papillary thyroidcarcinoma，PTC）和甲狀腺濾泡狀腺癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）［8］。文獻(xiàn)報(bào)道，MTC的10年生存率約為80%，而PTC和FTC的10年生存率分別為92%和90%［2］。目前公認(rèn)的MTC主要發(fā)病原因是由RET基因突變引起，大量研究已確認(rèn)RET基因突變是MTC發(fā)病的主要分子病因?qū)W基礎(chǔ)［4］，約94%的遺傳性MTC和70%的散發(fā)性MTC是由RET基因突變引起。但MTC是否還有其他發(fā)病機(jī)制，目前尚無定論。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與組織細(xì)胞內(nèi)的基因變化關(guān)系密切，某個(gè)或多個(gè)基因的缺失或激活都可能造成細(xì)胞的惡性增殖。RHOA/ROCK-2信號(hào)通路受多種上游因子調(diào)控，也可以影響多個(gè)下游因子，目前已知該通路與Wnt及Notch等多個(gè)經(jīng)典信號(hào)通路存在著極為緊密的關(guān)系［9，10］，而國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道Wnt信號(hào)通路與甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11，12］。RHOA/ROCK-2信號(hào)通路一旦被激活，將會(huì)影響其下游多種因子，如轉(zhuǎn)錄因子NFκB、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallo proteinase，MMP）、金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）等，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［13］。

圖1 癌旁組織及MTC HE染色及RHOA、ROCK-2免疫組織化學(xué)結(jié)果×200

表1 RHOA、ROCK-2在MTC及癌旁組織中的組織學(xué)檢查結(jié)果分析

表2 RHOA/ROCK-2信號(hào)通路與PTC臨床病理特征的關(guān)系

目前為止，RHOA/ROCK-2信號(hào)通路與MTC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究甚少。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了MTC中RHOA、ROCK-2蛋白的表達(dá)情況，并根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)估RHOA、ROCK-2與MTC患者的年齡、性別、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：30例MTC及癌旁組織中，MTC中RHOA陽(yáng)性27例（90.00%），ROCK-2陽(yáng)性24例（83.33%），癌旁甲狀腺組織中RHOA陽(yáng)性0例（0），癌旁甲狀腺組織中ROCK-2陽(yáng)性1例（3.33%），RHOA、ROCK-2在MTC中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：RHOA、ROCK-2的表達(dá)均與患者的性別、年齡及TNM分期無關(guān)，而ROCK-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究結(jié)果證明RHOA、ROCK-2在MTC中表達(dá)水平明顯升高，且MTC患者ROCK-2的高表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。盡管這些結(jié)果不能直接證明RHOA/ROCK-2信號(hào)通路與MTC的發(fā)生、發(fā)展存在著必然的聯(lián)系，但結(jié)合國(guó)外及其他領(lǐng)域的相關(guān)研究結(jié)果［14］，RHOA、ROCK-2極有可能與MTC乃至所有甲狀腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性。本研究例數(shù)相對(duì)較少，未檢測(cè)RET基因的變異情況，而且缺乏RHOA、ROCK-2基因水平的相關(guān)研究，今后我們會(huì)完善與之相關(guān)的基因水平實(shí)驗(yàn)，并在細(xì)胞水平上繼續(xù)探尋RHOA/ROCK-2信號(hào)通路與MTC的增殖、遷移、侵襲等方面的相關(guān)性?？傊?，闡明RHOA/ROCK-2信號(hào)通路對(duì)MTC發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制有著重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

［1］You YN，Lakhani V，Wells SA Jr，et al.Medullary thyroid cancer［J］.Surg Oncol Clin N Am，2006，14（3）：639-660.

［2］Gilliland FD，Hunt WC，Morris DM，et al.Prognostic factors for thyroid carcinoma.A population-based study of 14，698 cases from the Surveillance，Epidemiology and End Results（SEER）program 1973-1991［J］.Cancer，1997，79（3）：464-473.

［3］Chen AY，Jemal A，Ward EM.Increasing incidence of differentiated thyroid cancer in the United States，1988-2004［J］.Cancer，2009，14（16）：3801-3807.

［4］Boichard A，Croux L，Al Ghuzlan A，et al.Somatic RAS mutations occur in a large proportion of sporadic RET-negative medullary thyroid carcinomas and extend to a previously unidentified exon［J］.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（10）：E2031-E2034.

［5］Xie X，Peng J，Chang X，et al.Activation of RhoA/ROCK regulates NF-κB signaling pathway in experimental diabetic nephropathy［J］. Mol Cell Endocrinol，2013，369（1-2）：86-97.

［6］程木秋，霍海洋，張海山.RhoA/ROCK信號(hào)系統(tǒng)對(duì)血管外膜炎癥介導(dǎo)的大鼠頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和表型變化的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41（3）：220-223.

［7］Ridley AJ，Schwartz MA，Burridge K，et al.Cell migration：integrating signals from front to back［J］.Science，2003，302（4641）：1704-1709.

［8］Wartofsky L.Increasing world incidence of thyroid cancer：increased detection or higher radiation exposure［J］.Hormones，2010，9（2）：103-108.

［9］Peng L，Li Y，Shusterman K，et al.Wnt-RhoA signaling is involved in dental enamel development［J］.Eur J Oral Sci，2011，119（Suppl 1）：41-49.

［10］Venkatesh D，F(xiàn)redette N，Rostama B，et al.RhoA-mediated signaling in Notch-induced senescence-like growth arrest and endothelial barrier dysfunction［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（4）：876-882.

［11］楊棟，辛世杰，劉彥，等.Wnt4a在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)普通外科雜志，2013，22（11）：1479-1483.

［12］Kremenevskaja N，von Wasielewski R，Rao AS，et al.Wnt-4a has tumor suppressor activity in thyroid carcinoma［J］.Oncogene，2004，24（13）：2144-2144.

［13］Shimada H，Rajagopalan LE.Rho kinase-2 activation in human endothelial cells drives lysophosphatidic acid-mediated expression of cell adhesion molecules via NF-kappaB p64［J］.J Biol Chem，2010，284（17）：12436-12442.

［14］Zhong WB，Liang YC，Wang CY，et al.Lovastatin suppresses invasiveness of anaplastic thyroid cancer cells by inhibiting Rho geranylgeranylation and RhoA/ROCK signaling［J］.Endocr Relat Cancer，2004，12（3）：614-629.

（編輯 王又冬）

R736.1

A

0248-4646（2014）04-0364-03

汪穎厚（1986-），男，醫(yī)師，碩士.

王斌，E-mail：202wangbin@sina.com

2013-12-19

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