石磊等

【摘要】 探討石蠟標本中大腸癌腫瘤浸潤淋巴細胞亞群單細胞懸液樣本的制備方法。石蠟標本經切片、脫蠟、水化、消化、過濾、收集細胞等步驟制成單細胞懸液，滴加單克隆抗體，通過流式細胞儀檢測，最后進行淋巴細胞亞群細胞分型獲取及讀數(shù)。

【關鍵詞】 大腸癌； 腫瘤浸潤淋巴細胞； 石蠟包埋； 流式細胞術

腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）在體內外具有較強特異性殺傷腫瘤細胞的作用[1-2]。以往對腫瘤浸潤淋巴細胞的研究多從病理角度探討，對其淋巴細胞分型及量的表達研究甚少。隨著免疫檢測技術的發(fā)展，特別是流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）應用于免疫研究越來越廣泛，并具有快捷、敏感及多參數(shù)定量分析等優(yōu)點，目前這種檢測技術主要應用于臨床新鮮腫瘤組織和血液細胞研究[3-6]。近年來石蠟包埋組織單細胞分散方法的建立，擴大了流式細胞術的應用范圍，臨床病理資料的石蠟組織通過流式細胞術檢測分析，得到進一步的研究及利用。在石蠟包埋大腸癌腫瘤浸潤淋巴細胞亞群樣本制備國內外文獻鮮有報道，本實驗選取1990年6月-2006年6月本院60例石蠟包埋大腸癌組織，反復對大腸癌腫瘤淋巴單細胞懸液的制備方法進行探索，獲得了比較滿意的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取本院普通外科1990年6月-2006年6月收集的大腸石蠟標本組織共60例，標本組織均為病理證實的大腸癌組織，并進行單細胞懸液的制作。

1.2 方法

1.2.1 切片 將石蠟包埋組織切成40 μm厚的組織片，取7～8片放入10 mL試管中。

1.2.2 脫蠟 加入二甲苯5 mL，室溫中放置2 d，每天更換一次二甲苯，觀察石蠟是否脫凈，如組織切片全部在試管底部，表明石蠟已完全脫凈。

1.2.3 水化 依次加入100%、95%、70%、50%梯度酒精5 mL，每步時間均為10 min，然后加入0.9%生理鹽水漂洗后棄之。

1.2.4 消化 用剪刀剪碎組織，大小約1×1 mm，加入0.5%胃蛋白酶液2 mL（pH 1.5～2.0），置于37 ℃恒溫水浴中消化30 min，每隔5 min震蕩1次。消化30 min中后取出試管，組織成漿糊狀，立即加入0.9%生理鹽水終止。

1.2.5 過濾 經300目尼龍網過濾，未過濾的組織可利用眼科剪剪碎較大組織團塊，生理鹽水反復沖洗，直至細胞完全濾過尼龍網。吸管吹打單懸細胞液，防止細胞疊加。

1.2.6 收集淋巴細胞 將離心機調至1500 r/min離心10 min，0.9%生理鹽水漂洗，將單細胞懸液滴加至淋巴細胞分離液（密度1.077），梯度離心后取中間一層細胞即為淋巴細胞。800 r/min低速離心（2 min，2次），以去除細胞碎片。

1.2.7 流式細胞儀檢測 血細胞計數(shù)板讀取細胞數(shù)并調整單懸細胞濃度，取100 μL約1×106細胞至流式檢測管中，加入單克隆熒光抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，2 mL PBS漂洗，離心棄上清，最后加入固定液多聚甲醛150 μL上流式細胞儀檢測。

2 結果

單懸細胞經鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)完整、分散度好、細胞疊加及碎片少，背景干凈。通過血細胞板讀數(shù)見計數(shù)板每格內細胞數(shù)>10個，流式細胞術檢查均得到滿意圖組，見圖1。

3 討論

流式細胞術在腫瘤檢測方面成為越來越重要的手段之一[7-8]。自1983年Hedley成功報道了石蠟包埋腫瘤組織制備單細胞懸液方法后，大量的石蠟組織用于FCM技術，從而為腫瘤的診斷及預后提供了重要依據(jù)。但對于石蠟包埋腫瘤浸潤淋巴細胞的制備研究較少，這主要與腫瘤浸潤淋巴組織的單細胞懸液的制備較為困難有關，本實驗以Hedley制作單細胞懸液的方法為基礎，對60例石蠟包埋大腸癌腫瘤浸潤淋巴細胞的單細胞懸液制備進行探索。

腫瘤浸潤淋巴細胞的單細胞懸液制備是流式細胞術分析成功與否的關鍵之一。本實驗在預實驗階段曾采用胰蛋白酶作為大腸癌腫瘤組織的消化，但所得細胞濃度偏低，這可能與胰蛋白酶消化所需偏堿性環(huán)境有關，而應用胃蛋白酶在pH值1.5～2.0中消化獲得的單細胞懸液明顯增多。另一方面，在實驗初期采用機械法即研磨法，由于用力的不同，研磨過程中容易使完整的細胞受損，形成細胞碎片，使染色后出現(xiàn)低熒光性，出現(xiàn)假陽性，導致細胞檢出率較高。后期在研磨過程中注意動作輕柔，研磨均勻，同時在研磨過程中需生理鹽水反復沖洗，防止組織細胞多次研磨遭破壞，最終在光鏡下所觀察的細胞形態(tài)較完整，背景干凈。因此本項實驗通過對單細胞懸液制備，總結了以下心得體會：（1）標本的選?。菏灠窠M織塊需為完整，鏡檢大腸癌周圍淋巴細胞豐富；（2）切片質量：實驗證明病理切片厚度在40 μm左右較為理想，如切片過薄易形成細胞碎片，過厚則不易消化，容易形成細胞團塊；（3）脫蠟：切片脫蠟時間在室溫2 d可完全脫凈，如冬天室溫低，則需延長脫蠟時間或升高室內溫度，同時觀察如試管內切片無上浮則表明脫蠟干凈；（4）漂洗：切片經酒精水化后，需生理鹽水充分漂洗，酒精殘留則會破壞消化酶作用。勿用蒸餾水漂洗，這樣容易因低滲造成細胞膜結構的破壞；（5）組織的消化：選擇合適的消化酶，高度角化的鱗癌組織細胞排列緊密，選擇膠原蛋白酶較理想，軟組織肉瘤使用胰蛋白酶及脯蛋白酶較合適[9]。Zalupski等[10]對15例肉瘤組織進行單懸細胞的制備，實驗結果表明胰蛋白酶及脯蛋白酶提取優(yōu)于胃蛋白酶，懸液單細胞明顯增多。胃腸道及肝臟腫瘤應用胰蛋白酶及胃蛋白酶明顯優(yōu)于其他酶液[11]。本實驗使用胃蛋白酶，調整酶液pH值在1.5～2.0，100 mL生理鹽水中加入胃蛋白酶0.5 g，消化前需將組織剪碎，約1 mm×1 mm大小，使組織與消化液充分接觸，酶解完全。（6）減少細胞丟失：單細胞懸液因多次離心漂洗后使得大量細胞丟失，因此在離心時應選擇水平離心機，這可使細胞沉淀于試管底部，而使用垂直離心機容易使細胞附著試管管壁，去上清液時很容易造成細胞的丟失，同時改倒掉上清液為吸管吸出上清液，這樣能大大減少細胞的丟失，從而達到流式細胞儀檢測所需細胞數(shù)量。

本實驗通過對石蠟包埋大腸癌腫瘤浸潤淋巴細胞亞群的單細胞懸液的成功制備，并應用于流式細胞儀檢測。為進一步再分析大腸癌淋巴細胞免疫狀態(tài)與大腸癌病理特征、患者臨床分期及預后之間的聯(lián)系均具有實用意義。

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（收稿日期：2013-12-18） （本文編輯：歐麗）

本實驗通過對石蠟包埋大腸癌腫瘤浸潤淋巴細胞亞群的單細胞懸液的成功制備，并應用于流式細胞儀檢測。為進一步再分析大腸癌淋巴細胞免疫狀態(tài)與大腸癌病理特征、患者臨床分期及預后之間的聯(lián)系均具有實用意義。

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（收稿日期：2013-12-18） （本文編輯：歐麗）

本實驗通過對石蠟包埋大腸癌腫瘤浸潤淋巴細胞亞群的單細胞懸液的成功制備，并應用于流式細胞儀檢測。為進一步再分析大腸癌淋巴細胞免疫狀態(tài)與大腸癌病理特征、患者臨床分期及預后之間的聯(lián)系均具有實用意義。

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（收稿日期：2013-12-18） （本文編輯：歐麗）