李振華等

【摘要】 目的：應(yīng)用堿性裂解液法提取的DNA鑒定環(huán)氧化酶（COX）亞型基因敲除小鼠，為鑒定純合子小鼠提供一種方便快捷、低成本、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。方法：取子代小鼠耳緣組織于EP管中，用堿性裂解液提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增COX-1和COX-2基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小鼠基因型作出鑒定。結(jié)果：堿性裂解液法提取的DNA能應(yīng)用于子代小鼠的不同基因型的鑒定，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、雜合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和純合子（COX-1-/-；COX-2-/-）。結(jié)論：建立了堿性裂解液提取DNA法，并將該法成功應(yīng)用于環(huán)氧化酶亞型基因敲除小鼠基因型鑒定中。

【關(guān)鍵詞】 堿性裂解液； 環(huán)氧化酶； 基因敲除小鼠

環(huán)氧化酶（COX）催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）產(chǎn)生前列腺素類物質(zhì)，其中在心血管系統(tǒng)主要是前列環(huán)素（PGI2）和血栓烷A2（TxA2），COX作為AA代謝中主要的關(guān)鍵限速酶之一，在心血管方面發(fā)揮重要的病理生理作用[1]。COX主要包括COX-1和COX-2兩種亞型，由于現(xiàn)階段COX亞型選擇性抑制劑存在著非特異性作用，因此基因敲除小鼠對(duì)進(jìn)一步明確COX亞型的生理及病理生理功能具有重要作用，進(jìn)而建立COX亞型基因敲除小鼠的鑒定方法也就尤為重要[2]。目前，國(guó)內(nèi)基因敲除小鼠鑒定中DNA的提取主要有兩種方法，第一種即采用蛋白酶K消化后用經(jīng)典酚氯仿提取法：通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)，再加入乙醇即可使DNA分離出來(lái)；第二種即基因組DNA試劑盒提取法：通過裂解細(xì)胞釋放出基因組DNA，然后加入核糖核酸酶A去除RNA，接著選擇性沉淀去除蛋白，最后通過異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液[3-4]。堿性裂解液提取DNA法鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將建立一種用堿性裂解液提取DNA的方法，為COX亞型基因敲除小鼠鑒定提供更為方便、經(jīng)濟(jì)、快速的方法[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：COX亞型基因敲除小鼠引進(jìn)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理系，基因背景為COX-1+/-的雜合子小鼠2雌1雄，基因背景為COX-2+/-的雜合子小鼠2雌1雄，共6只。試劑：PCR試劑盒、DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；重要溶液地配制：溶液A，即NaOH溶液，成分為25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA，溶液B的成分為40 mmol/L Tris·HCl，pH值為8.0。儀器：干式恒溫器（奧盛儀器有限公司，中國(guó)），PCR擴(kuò)增儀（ABI公司，美國(guó)），電泳儀（北京六一儀器廠，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。溫度控制在22 ℃，光照周期為12 h黑暗，12 h光照；籠具、墊料、飼料和飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理后使用；自由取食和飲水，墊料一周更換兩次。采用1雄和2雌合籠方式進(jìn)行繁殖。在子代小鼠斷乳打耳號(hào)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，留取小鼠耳緣組織于1.5 mL EP管中，加入100 μL溶液A，于干式恒溫器100 ℃孵育30 min。再加入100 μL溶液B，充分震蕩混勻、離心，放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因組DNA擴(kuò)增 （1）COX-1引物序列：WT-S：

5-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3，KO-S：5-GCAGCCTCTGTTCCACATACAC-3，WT/KO-AS：5-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3。目的基因片段長(zhǎng)度為601 bp。各種基因型小鼠擴(kuò)增片段為：COX-1-/-：646 bp；COX-1+/-：601 bp和646 bp；COX-1+/+：601 bp。COX-2引物序列：WT-S：5-ACACACTCTATCACTGGCACC-3，KO-S：5-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3，WT/KO-AS：5-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3。目的基因片段長(zhǎng)度為905 bp。各種基因型小鼠擴(kuò)增片段為：COX-2-/-：905 bp；COX-2+/-：760 bp和905 bp；COX-2+/+：760 bp。（2）PCR體系：2× Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，引物WT-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物KO-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物WT/KO-AS（10 μmol/L）2.5 μL， 耳緣DNA模板樣品1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。（3）COX-1反應(yīng)條件：①預(yù)變性94 ℃，5 min；②變性94 ℃，30 s；③退火56 ℃，30 s；④延伸72 ℃，30 s，重復(fù)步驟②～④40次循環(huán)；⑤最后延伸72 ℃，7 min；⑥4 ℃保存。（4）COX-2反應(yīng)條件：①預(yù)變性94 ℃，5 min；②變性94 ℃，45 s；③退火56 ℃，45 s；④延伸72 ℃，45 s，重復(fù)步驟②～④35次循環(huán)；

⑤最后延伸72 ℃，7 min；⑥4 ℃保存。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 用TBE緩沖液配制1.2%瓊脂糖凝膠，待60 ℃左右加入溴化乙啶 （EB） 2 μL （10 mg/mL），混勻后，倒入凝膠板鋪板，室溫放置30 min，待凝膠完全凝固后放入電泳槽，加入PCR產(chǎn)物10 μL于點(diǎn)樣孔，調(diào)節(jié)電泳電壓為100 V，電泳40 min后，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

COX-1子代基因鑒定部分結(jié)果如圖1所示，凝膠最左側(cè)為Marker，編號(hào)2、5、6可見大小為646 bp左右的條帶，為純合子；編號(hào)1、3、4、7可見大小為646 bp和601 bp左右的條帶，為雜合子；編號(hào)8可見大小為601 bp左右的條帶，為野生型。

COX-2子代基因鑒定部分結(jié)果如圖2所示，凝膠最左側(cè)為Maker，編號(hào)3可見大小為905 bp左右的條帶，為純合子；編號(hào)1、2、4可見大小為905 bp和760 bp左右的條帶，為雜合子；編號(hào)5可見大小為760 bp左右的條帶，為野生型。

3 討論

小鼠基因敲除技術(shù)是研究整體動(dòng)物水平基因功能的一種直接有效方法，通過基因敲除動(dòng)物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前，心血管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進(jìn)一步明確。一般認(rèn)為，COX-1為結(jié)構(gòu)型，主要表達(dá)于正常組織，在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2為誘導(dǎo)型，又稱“炎癥反應(yīng)基因”，正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或少表達(dá)，當(dāng)受到刺激后便迅速表達(dá)合成，參與多種病理生理過程[8]。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制，有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[9]。

為了進(jìn)一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子，嚴(yán)格按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖，由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、雜合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和純合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必須對(duì)其子代進(jìn)行基因鑒定，從而分辨出純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實(shí)驗(yàn)室常用試劑，但是較堿性裂解液提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用；試劑盒提取法提純效率和純度都比較高，但相比堿性裂解液提取法而言費(fèi)用較高，且過程較之復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過程簡(jiǎn)單、快捷、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。通過對(duì)不同亞型的COX基因的鑒定，驗(yàn)證了該方法的可靠性。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中筆者亦觀察到：COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠分娩，而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕，與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10]。故在COX基因亞型敲除小鼠繁殖過程中應(yīng)采用雜合子雌鼠作為母鼠，才能得到純合子的子鼠用于實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，堿性裂解液提取DNA法能很好地應(yīng)用在不同基因型的COX基因亞型敲除小鼠的鑒定中，為基因敲除小鼠鑒定提供了一種便捷、可靠的方法。通過一段時(shí)間的繁育及鑒定，得到較多純合子小鼠，為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COX亞型對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了必要的條件。

參考文獻(xiàn)

[1] Félétou M， Huang Y， Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone： COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol， 2011， 164（3）：894-912.

[2]張子房，唐煒，尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2009，6（17）：12-15.

[3]董子龍，莊然，張宇絲，等.PTA-1-/-/ApoE-/-雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29（5）：6-8.

[4]杜智勇，粟永萍，楊天德，等.類固醇受體輔活化子-1基因敲除小鼠的繁殖與篩選[J].重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（4）：326-327.

[5] Zhang Y H，Huang B L，Eastman K，et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab，2006，89（12）：164-167.

[6]趙國(guó)陽(yáng)，李光飛，徐又佳.基因敲除技術(shù)在骨質(zhì)疏松相關(guān)基因研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2011，17（8）：748-752.

[7]王燕杰.環(huán)氧合酶及其抑制劑與宮頸癌的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2012，19（6）：703-704.

[8]張一弛，牟艷玲，解硯英.COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系[J].研究進(jìn)展生命科學(xué)，2012，24（1）：63-68.

[9]蔣躍絨，殷惠軍，陳可冀.環(huán)氧合酶與心血管疾病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2006，27（5）：627-630.

[10] St-Louis I， Singh M， Brasseur K，et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic，pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol，2010，24（8）：103.

（收稿日期：2013-11-13） （本文編輯：黃新珍）

COX-2子代基因鑒定部分結(jié)果如圖2所示，凝膠最左側(cè)為Maker，編號(hào)3可見大小為905 bp左右的條帶，為純合子；編號(hào)1、2、4可見大小為905 bp和760 bp左右的條帶，為雜合子；編號(hào)5可見大小為760 bp左右的條帶，為野生型。

3 討論

小鼠基因敲除技術(shù)是研究整體動(dòng)物水平基因功能的一種直接有效方法，通過基因敲除動(dòng)物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前，心血管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進(jìn)一步明確。一般認(rèn)為，COX-1為結(jié)構(gòu)型，主要表達(dá)于正常組織，在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2為誘導(dǎo)型，又稱“炎癥反應(yīng)基因”，正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或少表達(dá)，當(dāng)受到刺激后便迅速表達(dá)合成，參與多種病理生理過程[8]。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制，有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[9]。

為了進(jìn)一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子，嚴(yán)格按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖，由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、雜合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和純合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必須對(duì)其子代進(jìn)行基因鑒定，從而分辨出純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實(shí)驗(yàn)室常用試劑，但是較堿性裂解液提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用；試劑盒提取法提純效率和純度都比較高，但相比堿性裂解液提取法而言費(fèi)用較高，且過程較之復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過程簡(jiǎn)單、快捷、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。通過對(duì)不同亞型的COX基因的鑒定，驗(yàn)證了該方法的可靠性。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中筆者亦觀察到：COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠分娩，而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕，與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10]。故在COX基因亞型敲除小鼠繁殖過程中應(yīng)采用雜合子雌鼠作為母鼠，才能得到純合子的子鼠用于實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，堿性裂解液提取DNA法能很好地應(yīng)用在不同基因型的COX基因亞型敲除小鼠的鑒定中，為基因敲除小鼠鑒定提供了一種便捷、可靠的方法。通過一段時(shí)間的繁育及鑒定，得到較多純合子小鼠，為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COX亞型對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了必要的條件。

參考文獻(xiàn)

[1] Félétou M， Huang Y， Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone： COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol， 2011， 164（3）：894-912.

[2]張子房，唐煒，尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2009，6（17）：12-15.

[3]董子龍，莊然，張宇絲，等.PTA-1-/-/ApoE-/-雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29（5）：6-8.

[4]杜智勇，粟永萍，楊天德，等.類固醇受體輔活化子-1基因敲除小鼠的繁殖與篩選[J].重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（4）：326-327.

[5] Zhang Y H，Huang B L，Eastman K，et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab，2006，89（12）：164-167.

[6]趙國(guó)陽(yáng)，李光飛，徐又佳.基因敲除技術(shù)在骨質(zhì)疏松相關(guān)基因研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2011，17（8）：748-752.

[7]王燕杰.環(huán)氧合酶及其抑制劑與宮頸癌的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2012，19（6）：703-704.

[8]張一弛，牟艷玲，解硯英.COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系[J].研究進(jìn)展生命科學(xué)，2012，24（1）：63-68.

[9]蔣躍絨，殷惠軍，陳可冀.環(huán)氧合酶與心血管疾病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2006，27（5）：627-630.

[10] St-Louis I， Singh M， Brasseur K，et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic，pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol，2010，24（8）：103.

（收稿日期：2013-11-13） （本文編輯：黃新珍）

COX-2子代基因鑒定部分結(jié)果如圖2所示，凝膠最左側(cè)為Maker，編號(hào)3可見大小為905 bp左右的條帶，為純合子；編號(hào)1、2、4可見大小為905 bp和760 bp左右的條帶，為雜合子；編號(hào)5可見大小為760 bp左右的條帶，為野生型。

3 討論

小鼠基因敲除技術(shù)是研究整體動(dòng)物水平基因功能的一種直接有效方法，通過基因敲除動(dòng)物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前，心血管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進(jìn)一步明確。一般認(rèn)為，COX-1為結(jié)構(gòu)型，主要表達(dá)于正常組織，在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2為誘導(dǎo)型，又稱“炎癥反應(yīng)基因”，正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或少表達(dá)，當(dāng)受到刺激后便迅速表達(dá)合成，參與多種病理生理過程[8]。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制，有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[9]。

為了進(jìn)一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子，嚴(yán)格按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖，由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、雜合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和純合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必須對(duì)其子代進(jìn)行基因鑒定，從而分辨出純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實(shí)驗(yàn)室常用試劑，但是較堿性裂解液提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用；試劑盒提取法提純效率和純度都比較高，但相比堿性裂解液提取法而言費(fèi)用較高，且過程較之復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過程簡(jiǎn)單、快捷、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。通過對(duì)不同亞型的COX基因的鑒定，驗(yàn)證了該方法的可靠性。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中筆者亦觀察到：COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠分娩，而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕，與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10]。故在COX基因亞型敲除小鼠繁殖過程中應(yīng)采用雜合子雌鼠作為母鼠，才能得到純合子的子鼠用于實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，堿性裂解液提取DNA法能很好地應(yīng)用在不同基因型的COX基因亞型敲除小鼠的鑒定中，為基因敲除小鼠鑒定提供了一種便捷、可靠的方法。通過一段時(shí)間的繁育及鑒定，得到較多純合子小鼠，為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COX亞型對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了必要的條件。

參考文獻(xiàn)

[1] Félétou M， Huang Y， Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone： COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol， 2011， 164（3）：894-912.

[2]張子房，唐煒，尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2009，6（17）：12-15.

[3]董子龍，莊然，張宇絲，等.PTA-1-/-/ApoE-/-雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29（5）：6-8.

[4]杜智勇，粟永萍，楊天德，等.類固醇受體輔活化子-1基因敲除小鼠的繁殖與篩選[J].重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（4）：326-327.

[5] Zhang Y H，Huang B L，Eastman K，et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab，2006，89（12）：164-167.

[6]趙國(guó)陽(yáng)，李光飛，徐又佳.基因敲除技術(shù)在骨質(zhì)疏松相關(guān)基因研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2011，17（8）：748-752.

[7]王燕杰.環(huán)氧合酶及其抑制劑與宮頸癌的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2012，19（6）：703-704.

[8]張一弛，牟艷玲，解硯英.COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系[J].研究進(jìn)展生命科學(xué)，2012，24（1）：63-68.

[9]蔣躍絨，殷惠軍，陳可冀.環(huán)氧合酶與心血管疾病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2006，27（5）：627-630.

[10] St-Louis I， Singh M， Brasseur K，et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic，pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol，2010，24（8）：103.

（收稿日期：2013-11-13） （本文編輯：黃新珍）