王廣新等

【摘要】 目的：探討難治性癲癇患者腦內(nèi)缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）與多藥耐藥基因1（MDR1）的表達情況、相關性及其意義。方法：收集9例難治性癲癇組手術切除腦組織標本及7例對照組腦組織標本，采用免疫組織化學染色方法檢測HIF-1α和MDR1的表達情況，并分析HIF-1α與MDR1表達陽性率的相關性。結(jié)果：HIF-1α在難治性癲癇組腦組織中的陽性表達率77.8%（7/9）明顯高于對照組的14.3%（1/7）；MDR1在難治性癲癇組腦組織中的陽性表達率66.7%（6/9）明顯高于對照組的14.3%（1/7），比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；難治性癲癇組腦組織中HIF-1α與MDR1的表達呈正相關（r=0.76，P<0.05）。結(jié)論：難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF-1α和MDR1表達升高，且兩者呈正相關。HIF-1α可能通過調(diào)控MDR1基因表達而參與難治性癲癇的形成。

【關鍵詞】 缺氧誘導因子1α； 多藥耐藥基因1； 難治性癲癇

癲癇是一組由大量神經(jīng)元反復發(fā)作的異常放電而引起的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)短暫性功能失常為特征的慢性腦部疾病。70%～80%癲癇患者經(jīng)系統(tǒng)、正規(guī)應用抗癲癇藥治療可獲得長期緩解，其余20%～30%患者的發(fā)作不能得到有效控制，成為難治性癲癇（refractory epilepsy，RE）或稱耐藥性癲癇[1]。難治性癲癇的形成原因復雜，涉及多種因素，如遺傳因素；多種癲癇發(fā)作類并存，某些癲癇類型如嬰兒痙攣癥、腦部器質(zhì)性病變等[2]。多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）作為人體內(nèi)主要的藥物轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的編碼基因，是首個被發(fā)現(xiàn)與難治性癲癇有關的基因，該基因的高表達是難治性癲癇形成的重要生物學基礎。目前，難治性癲癇腦組織中MDR1高表達的機制研究廣受關注，如有研究發(fā)現(xiàn)MDR1基因的多態(tài)性可引起MDR1表達異常；還有研究者認為癇性發(fā)作本身也可引起P-gp表達升高。但是。從MDR1基因的調(diào)控通路角度探討P-gp升高的機制，國內(nèi)外研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)在MDR1基因啟動子上存在功能性的缺氧誘導因子1α（hypoxia induced factor 1α，HIF-1α）結(jié)合位點，缺氧時，HIF-1α可通過調(diào)控MDR1基因誘導MDR1/P-gp的表達增加[3]。由于癲癇發(fā)作時出現(xiàn)大量神經(jīng)元的異常放電，耗氧量增加，存在大腦局部微環(huán)境缺氧。但是，難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF-1α和MDR1的表達情況及兩者的聯(lián)系有待研究。本研究采用免疫組織化學方法檢測難治性癲癇患者腦組織中HIF-1α和MDR1的表達情況，分析HIF-1α與MDR1表達陽性率的相關性，以期在體探討HIF-1α在難治性癲癇發(fā)生機制中的作用，為難治性癲癇治療尋找新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年在山東大學附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科診斷為難治性癲癇且進行手術治療的9例患者作為難治性癲癇組，所有患者均符合吳遜、沈鼎烈等（1998）提出的標準，其中男5例，女4例，平均（39.56±13.56）歲，癲癇病史4～13年，發(fā)作類型為：復雜部分性發(fā)作3例，復雜部分性發(fā)作繼發(fā)全部性發(fā)作2例，強直-陣攣發(fā)作1例，陣攣性發(fā)作2例，失神發(fā)作1例。同時另選取7例非癲癇患者作為對照組，其中男5例，女2例，平均（35.71±12.24）歲，腦血管畸形4例，腦外傷手術3例，入組標準：（1）無癲癇或熱性驚厥等病史；（2）無腫瘤病史；（3）無陽性癲癇家族史；（4）無其他嚴重的慢性神經(jīng)系統(tǒng)進行性疾病等。以上受試對象均對本研究簽署知情同意書。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器 Mdr-1小鼠抗人單克隆抗體、HIF-1α小鼠抗人單克隆抗體（santa cruz）；免疫組化染色試劑盒SP-9002（北京中杉金橋生物技術公司）；光學顯微鏡Olympus CH-20（Olympus）；數(shù)顯恒溫水浴箱（江蘇省常州國華公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化 受試對象手術后立即取其大腦組織標本，其中難治性癲癇組腦組織的取材部位盡量在癲癇波異常放電的中心區(qū)。所有標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，采用SP-9002免疫組化染色試劑盒行免疫組織化學染色，操作按照說明書要求進行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結(jié)果判斷標準 HIF-1α和MDR1陽性表達以細胞膜和/或細胞漿中出現(xiàn)清晰棕褐色顆粒為準，采用半定量評分系統(tǒng)進行判定。根據(jù)參考文獻[4]的判斷方法如下：每例均高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果，陰性為0分，陽性細胞<25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，陽性細胞>75%為4分。陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++），（-）界定為陰性表達，（+）～（+++）判為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 用SPSS 11.0 for Windows軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，方差不齊時采用Mann-Whitney 秩檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，相關研究采用Spearman等級相關分析，雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腦組織中HIF-1α的表達比較 兩組腦組織中HIF-1α陽性染色呈彌漫分布，主要分布于星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，見圖1。HIF-1α在難治性癲癇組腦組織中的陽性表達率77.8%（7/9）明顯高于對照組的14.3%（1/7），比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.35，P<0.05）。

注：陽性細胞為棕褐色

2.2 兩組腦組織中MDR1的表達比較 免疫組化結(jié)果顯示MDR1陽性染色在兩組腦組織中主要定位于細胞胞漿及細胞膜中，見圖2。難治性癲癇組腦組織MDR1陽性表達率為66.7%（6/9），對照組腦組織陽性表達率為14.3%（1/7），比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=4.39，P<0.05）。

注：陽性細胞為棕褐色

2.3 難治性癲癇組腦組織中HIF-1α和MDR1陽性表達的關系 經(jīng)Spearman等級相關分析，HIF-1α和MDR1在難治性癲癇組腦組織中的表達呈正相關關系（r=0.76），比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=5.14，P=0.02），見表1。

3 討論

難治性癲癇是最棘手的臨床問題之一，其發(fā)生機制至今尚未完全明確。癲癇的長期反復發(fā)作，不僅使患者不斷遭受軀體痛苦，而且在一定程度上導致患者心理障礙及引起一系列社會問題[5]。目前難治性癲癇的治療方法有使用新型抗癲癇藥及手術治療等，但效果均不佳或手術存在后遺癥。因此，闡明難治性癲癇的耐藥機制，尋找新的藥物靶點，成為國內(nèi)外癲癇工作者研究的熱點和難點。

目前認為MDR1的高表達是難治性癲癇發(fā)生的重要基礎[6]。但是，難治性癲癇患者MDR1高表達的分子機制是什么？至今尚未明了，這是本項目研究的切入點。從基因表達調(diào)控的角度探討難治性癲癇的形成機制將是未來難治性癲癇研究的重要發(fā)展方向。近年來，缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）對MDR1基因的調(diào)控作用受到人們的關注。1992年Semenza和Wallg在低氧的肝癌細胞株HeP3B細胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)一種蛋白特異性地結(jié)合于紅細胞生成素（EPO）基因增強子的寡核苷酸序列，命名為缺HIF-l。HIF-1由缺氧誘導產(chǎn)生，是唯一在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，它由α和β兩種亞基聚合而成，其中HIF-1β是結(jié)構(gòu)性亞基，不論低氧或是常氧，它的mRNA和蛋白表達水平都保持在一個恒定水平；HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，它決定HIF-1的活性，氧對HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過該亞基，它的cDNA全長為3720 bp，開放閱讀框2478 bp，位于14號染色體（14q21-q24），編碼826個氨基酸。HIF-lα是主要的調(diào)節(jié)及活性亞基，由氧濃度嚴格調(diào)控，常氧下，通過泛素-蛋白酶體途徑被迅速降解，表達量少；而在低氧條件下，HIF-lα的泛素化和降解過程受抑制，在胞內(nèi)積聚、穩(wěn)定并轉(zhuǎn)位，由胞漿進入胞核，在胞核內(nèi)與HIF-1β形成二聚體，HIF復合體形成后即轉(zhuǎn)錄激活，激活的HIF復合體與缺氧反應基因的缺氧反應元件低氧反應元件（hypoxic response element，HRE）上的HIF-1結(jié)合位點結(jié)合，促進下游靶基因如MDR1、p53的轉(zhuǎn)錄，引發(fā)細胞對缺氧的一系列適應性反應[7-8]。Wartenberg等[9]在體外研究中發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境可上調(diào)P-gp表達，且需要HIF-1α的參與，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在MDR1基因啟動子上存在功能性的HIF-1α結(jié)合位點，缺氧時，HIF-1α可通過調(diào)控MDR1基因誘導MDR1/P-gp的表達增加[10-11]。另外，有研究者在乳腺癌細胞采用反義寡核苷酸封閉HIF-1α表達后，可明顯抑制缺氧誘導的MDR1表達，這些證據(jù)顯示，人體內(nèi)在缺氧環(huán)境下存在HIF-1α對MDR1基因表達調(diào)控的通路。

由于癲癇發(fā)作時出現(xiàn)大量神經(jīng)元的異常放電，則會伴有能量消耗，耗氧量也就增加，另外，難治性癲癇腦組織中存在與腦缺氧缺血性疾病一致的病理改變，如神經(jīng)元退行性損傷和星形膠質(zhì)細胞反應性增生，因此，難治性癲癇存在大腦局部微環(huán)境缺氧是明確的[11]。本課題假定癲癇發(fā)作→缺氧→HIF-1α的產(chǎn)生→MDR1基因表達→P-gp上調(diào)→大腦細胞內(nèi)藥物濃度下降→耐藥這一連串變化參與了難治性癲癇的形成。

本研究收集了難治性癲癇組手術切除腦組織標本及對照組腦組織標本，通過在體研究，采用免疫組織化學染色方法檢測難治性癲癇患者腦組織HIF-1α和MDR1的表達情況，并分析了HIF-1α和MDR1表達陽性率的相關性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HIF-1α在難治性癲癇組腦組織中的陽性表達率明顯高于對照組（P<0.05）；MDR1表達產(chǎn)物P-gp在難治性癲癇組腦組織中的陽性表達率明顯高于對照組（P<0.05）；難治性癲癇組腦組織中HIF-1α與MDR1表達產(chǎn)物P-gp的表達呈正相關（r=0.76）。

總之，本研究得出的初步結(jié)論是：難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF-1α與MDR1高表達相關；HIF-1α可能通過調(diào)控MDR1基因表達而參與難治性癲癇的形成；HIF-1α可能是難治性癲癇治療的新靶點。但是，由于對難治性癲癇的手術治療存在偏見，我省開展的難治性癲癇手術治療病例較少，因此獲取大量的難治性癲癇患者腦組織標本較困難，本課題僅對9例難治性癲癇組患者進行研究，樣本量小，是本研究的不足之處，有待擴大樣本量作進一步研究，也有待于進一步開展難治性癲癇的動物模型、細胞膜型研究，以驗證本研究得出的初步結(jié)論。

參考文獻

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（收稿日期：2013-12-16） （本文編輯：歐麗）

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（收稿日期：2013-12-16） （本文編輯：歐麗）