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        羅非魚副產(chǎn)物對(duì)米曲霉產(chǎn)酶及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

        2014-03-20 11:38:32張紅杰劉小玲劉伯科
        食品與機(jī)械 2014年4期
        關(guān)鍵詞:制曲態(tài)氮銨鹽

        張紅杰 劉小玲 劉伯科 秦 溪

        (廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧 530004)

        魚露是一種風(fēng)味獨(dú)特的水產(chǎn)調(diào)味料,其液體清澈為琥珀色,具有獨(dú)特的鮮味,富含必需氨基酸、多種礦物元素和維生素,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1]。泰國(guó)、越南、中國(guó)等[2]是魚露的主要生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)家,中國(guó)則主要集中在東南沿海,如[3]潮汕、福州等地。魚露主要是以低值小魚蝦或水產(chǎn)品加工下腳料為原料[4],經(jīng)25%~30%的鹽腌漬,在自然或恒溫條件下,利用魚體自身的組織蛋白酶的酶解自溶作用,將大分子的魚體蛋白質(zhì)水解成小分子的多肽、氨基酸;再在嗜鹽微生物的作用下,產(chǎn)生各種鮮味氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)的調(diào)味醬汁,一般發(fā)酵周期在1~3年之間[5]。

        醬油因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,已成為中國(guó)及東亞國(guó)家重要的調(diào)味品。它主要是以大豆、小麥、麩皮為基本原料,通過(guò)米曲霉前期制曲產(chǎn)酶,后期加鹽加水發(fā)酵,在米曲霉分泌的蛋白酶、淀粉酶等共同作用下,使大分子的蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),水解成小分子的多肽、氨基酸、葡萄糖等其他的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)。

        將魚露的原料—水產(chǎn)動(dòng)物蛋白添加到傳統(tǒng)的醬油原料豆粕中,利用醬油釀造的菌種米曲霉的代謝產(chǎn)生的蛋白酶,將動(dòng)植物蛋白轉(zhuǎn)化為呈味肽和其他小分子物質(zhì),縮短發(fā)酵周期[6],獲得一種具有香甜味,沒(méi)有明顯腐臭味和魚腥味[7],呈現(xiàn)顯著鮮味的復(fù)合發(fā)酵制品是本課題的目的和出發(fā)點(diǎn)。本研究擬探究添加羅非魚魚排進(jìn)行混合制曲對(duì)米曲霉產(chǎn)酶能力的影響,以及魚排不同的添加方式對(duì)后續(xù)固態(tài)發(fā)酵制品品質(zhì)的影響,從而為提高混合制曲酶活力,加快原料蛋白水解,提高原料利用率和增加魚醬油的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        羅非魚魚排:南寧市百洋水產(chǎn)有限公司;

        豆粕、麩皮、小麥:南寧市白蒼嶺市場(chǎng);

        GIM 3.451米曲霉:廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心;

        凱式定氮儀:KDN-04A 型,丹麥Foss公司;

        電子天平:FA-1004型,瑞士Mettler Toledo公司;

        自動(dòng)高壓滅菌鍋:YX280A 型,上海三申醫(yī)療器械有限公司;

        恒溫發(fā)酵箱:PYX-250H-C型,廣東省醫(yī)療器械廠;

        分光光度計(jì):722N 型,上海菁華科技儀器有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 菌種培養(yǎng) 將GIM 3.451米曲霉菌種接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基,28 ℃下恒溫培養(yǎng)2~4d,待試管內(nèi)長(zhǎng)滿黃綠色孢子即可。再轉(zhuǎn)移到三角瓶擴(kuò)培(培養(yǎng)條件同試管培養(yǎng)),得到種曲。

        1.2.2 魚、豆混合制曲 豆粕、麩皮、小麥等是傳統(tǒng)醬油釀制的主要原料,通過(guò)前期研究得出了以豆粕為主要氮源,小麥和麩皮作為主要碳源,制曲的最佳原料配比為豆粕、麩皮、小麥按6∶3∶1添加,水添加量為原料質(zhì)量的110%。本研究在不改變總體碳氮比的基礎(chǔ)上,通過(guò)加入魚排替代一定比例的豆粕,進(jìn)行混合制曲(魚、豆混合制曲),研究魚排的加入對(duì)制曲蛋白酶活力的影響。

        1.2.3 低鹽固態(tài)發(fā)酵 前期研究得出魚排經(jīng)切碎、蒸煮、冷卻后加醬油曲發(fā)酵制備魚醬油(魚后期添加)的最優(yōu)原料配比為成曲和魚排(濕計(jì))按8∶4添加,水的添加量為成曲和魚排總質(zhì)量的40%,醬醪鹽度為5%,發(fā)酵溫度為50 ℃。魚、豆混合制備的成曲由于水分含量較低(30%~40%),為保證相同條件下發(fā)酵,水分添加量為成曲質(zhì)量的80%,其它條件與加曲發(fā)酵制備魚醬油條件相同。

        根據(jù)GB 18186—2000,醬油中氨基酸態(tài)氮含量是醬油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的體現(xiàn),蛋白水解率可直觀的反應(yīng)出原料的利用率,總酸值為重要的滋味指標(biāo),銨鹽是醬油安全品質(zhì)的一個(gè)重要體現(xiàn)之一。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定混合制曲、豆粕制曲及魚排后期醬醪中氨基酸態(tài)氮、蛋白水解率、銨鹽隨時(shí)間的變化,比較3種發(fā)酵工藝之間的差異。

        1.2.4 測(cè)定方法

        (1)制曲原料的化學(xué)成分測(cè)定:蛋白質(zhì)和總氮的測(cè)定,參照GB 5009.5—2010;粗脂肪的測(cè)定,參照GB/T 5009.6—2003;粗淀粉的測(cè)定,參照GB/T 5009.6—2008;水分含量的測(cè)定,參照GB/T 9695.15—2008;灰分的測(cè)定,參照GB/T 5505—2008(豆粕、小麥、麩皮)和GB/T 9695.18—2008(魚排)。

        (2)蛋白酶活力的測(cè)定:參照SB/T 10317—1999 的福林酚法。

        根據(jù)SB/T 10317—1999的測(cè)定方法,制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,其中酪氨酸濃度與吸光值(OD660nm)的線性回歸方程:

        式中:

        Y——酪氨酸濃度,μg/mL;

        X——吸光值(OD660nm);

        其中R2=0.999 8,說(shuō)明線性相關(guān)性良好。

        圖1 蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure1 Protease activity standard curve

        (3)醬醪中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定:參照GB/T 5009.39—2003中甲醛滴定法。按式(1)計(jì)算氨基酸態(tài)氮的百分含量:

        式中:

        PA——醬醪中氨基酸態(tài)氮的百分含量,%;

        AN——醬醪中氨基酸態(tài)氮的含量,g;

        M——醬醪的干重,g。

        (4)蛋白水解率測(cè)定:參照何雪蓮的測(cè)定方法[8]。按式(2)計(jì)算蛋白水解率:

        式中:

        DH——蛋白水解率,%;

        AN——發(fā)酵后醬醪中氨基酸態(tài)氮含量,g;

        AN0——發(fā)酵前醬醪中氨基酸態(tài)氮含量,g;

        TN——發(fā)酵前醬醪中總氮含量,g。

        (5)銨鹽的測(cè)定:參照GB/T 5009.39—2003 的半微量定氮法。按式(3)計(jì)算醬醪中銨鹽的百分?jǐn)?shù):

        式中:

        PT——醬醪中銨鹽的百分?jǐn)?shù),%;

        SN——醬醪中銨鹽的質(zhì)量,g;

        M——醬醪的干重,g。

        1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有樣品進(jìn)行3組平行試驗(yàn),數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異性分析(ANOVA),P<0.05 表示存在顯著差異,使用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 制曲原料的基本化學(xué)組成

        制曲原料的化學(xué)物質(zhì)為米曲霉的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng),同時(shí)也是醬油營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味的來(lái)源。幾種主要原料的基本組成見(jiàn)表1,其中豆粕粗蛋白含量最高,且價(jià)格低廉,是目前醬油發(fā)酵的主要氮源,而羅非魚魚排粗蛋白含量高達(dá)36%(干基計(jì)折算后),與豆粕蛋白質(zhì)含量接近,可作為良好的氮源。小麥和麩皮淀粉含量較高,是醬油發(fā)酵的良好碳源,而且淀粉質(zhì)原料是形成醬油中葡萄糖、酒精、甘油、脂類物質(zhì)的主要原料等,直接影響到醬油的成色和風(fēng)味;而且麩皮疏松,便于通風(fēng),有利于米曲霉生長(zhǎng),提高酶活。魚排的水分和油脂含量較高,如果單獨(dú)采用魚排制曲,米曲霉生長(zhǎng)緩慢,同時(shí)也容易污染雜菌[9]。如用魚排和豆粕混合制曲,則可有望解決魚排單獨(dú)制曲的不足,同時(shí)魚排中灰分含量高,如采用混合制曲,通過(guò)后期發(fā)酵制備魚醬油,魚骨中的鈣可與產(chǎn)品中乳酸、氨基酸等結(jié)合,從而提高產(chǎn)品中的鈣離子含量。

        由于羅非魚魚排水分含量高達(dá)60%,其干基蛋白質(zhì)含量與豆粕相近,故后期試驗(yàn)魚排添加量折算成干基量,實(shí)際濕計(jì)添加量為干基的兩倍。

        2.2 魚排的替代量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響

        在制備成曲過(guò)程中,米曲霉主要產(chǎn)生中性、堿性、酸性3種蛋白酶,但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行,醬醪pH 下降,堿性蛋白酶酶活受到抑制,本試驗(yàn)選用酸性、中性蛋白酶酶活作為測(cè)定指標(biāo)。

        由于魚排水分含量高,不同魚排替代量,對(duì)應(yīng)的水分添加量也不一樣,故在相同外界條件下進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,隨魚排(干基)替代量逐步增加,成曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力都呈下降趨勢(shì),但1/6~1/3的豆粕被魚排替代時(shí),中性和酸性蛋白酶酶活力下降不顯著(P<0.05)。因此魚排替代部分豆粕作為氮源,最高不應(yīng)大于豆粕總量的1/3。

        2.3 潤(rùn)水量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響

        由于羅非魚魚排的水分含量接近60%,魚排的添加使得原料的水分含量增加,外加水量下降。由圖3可知,隨著潤(rùn)水量的增加,中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力都是先增加后降低,當(dāng)潤(rùn)水量在40%和50%時(shí)中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力達(dá)到較優(yōu)值,且無(wú)明顯差異,由于高水分會(huì)抑制米曲霉的生長(zhǎng),容易感染雜菌,出現(xiàn)壞曲[9]的情況,故選擇40%的潤(rùn)水量進(jìn)行后期發(fā)酵制曲。

        表1 制曲原料的基本化學(xué)組成Table1 Composition of starter-making raw material(n=3,X±SD) /%

        圖2 魚排替代豆粕量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響Figure2 Effect of substitute ratio of soybean by fish ribs on the protease activity of Aspergillus oryzae

        圖3 潤(rùn)水量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響Figure3 Effect of water content on the protease activity of Aspergillus oryzae

        2.4 米曲霉接種量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響

        米曲霉接種量后于28 ℃恒溫培養(yǎng)72h,比較米曲霉接種量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響。由圖4可知,隨著接種量的增加,兩種蛋白酶活力均呈上升趨勢(shì),當(dāng)接種量為4×106CFU/100g時(shí),兩種酶的酶活達(dá)到最大值。但接種量為3× 106CFU/100g和4×106CFU/100g 時(shí),對(duì)酶活力影響無(wú)顯著差異,故選用3×106CFU/100g為最適接種量。

        圖4 米曲霉接種量對(duì)米曲霉產(chǎn)酶活力的影響Figure4 Effect of original spores on the protease activity of Aspergillus oryzae

        2.5 制曲過(guò)程中米曲霉產(chǎn)酶活力的變化

        羅非魚排添加并部分替代豆粕制曲,對(duì)米曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)中性蛋白酶和酸性蛋白酶有一定的抑制作用,但是魚排替代豆粕比例在1/3以內(nèi)時(shí),對(duì)中性和酸性蛋白酶活力的影響較小,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)魚、豆混合制曲的潤(rùn)水量為40%,接種量為3×106CFU/100g時(shí)獲得最高的酶活力。以豆粕、麩皮、小麥三者原料配比6∶3∶1,潤(rùn)水量110%為對(duì)照組與魚排替代1/3豆粕量,潤(rùn)水量40%,接種量3×106CFU/100g,對(duì)魚、豆混合制曲隨時(shí)間變化進(jìn)行比較,測(cè)定指標(biāo)為中性蛋白酶,酸性蛋白酶活力(干基)。由感官觀察發(fā)現(xiàn)在制曲后36h,米曲霉生長(zhǎng)緩慢,菌絲較少,故從36h開(kāi)始,每隔12h測(cè)定一次,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

        圖5 中性蛋白酶活力在兩種制曲方式中隨時(shí)間的變化Figure5 Neutral protease activity changes over time of two starter-making ways

        由圖5 可知,豆粕單獨(dú)制曲過(guò)程中中性蛋白酶活力在60h和72h之間無(wú)明顯差異,且達(dá)到較優(yōu)值;魚豆混合制曲在72h時(shí)中性蛋白酶活力達(dá)到最大值,其中魚、豆混合制曲(1 710U/g)大于豆粕單獨(dú)制曲(1 559U/g)。

        由圖6可知,豆粕單獨(dú)制曲與魚、豆混合制曲過(guò)程中酸性蛋白酶活力均在72h達(dá)到較優(yōu)值,且豆粕制曲(179U/g)與魚、豆混合制曲(148U/g)相差不大。

        圖6 酸性蛋白酶活力在兩種制曲方式中隨時(shí)間的變化Figure6 Acid protease activity changes over time of two starter-making ways

        綜上可知,魚、豆混合制曲的最佳原料配比為魚排(干基)、豆粕、麩皮、小麥按2∶4∶3∶1進(jìn)行添加,接種量為3×106CFU/100g,水分添加量為原料質(zhì)量的40%,發(fā)酵時(shí)間為72h時(shí)可獲得較優(yōu)中性蛋白酶(1 710U/g)和酸性蛋白酶活力(148U/g),從而為后期醬醪發(fā)酵加速底物的水解創(chuàng)造了條件。同時(shí)與魚排粉碎酶解后,進(jìn)行液體制曲[8]相比,具有操作簡(jiǎn)單,蛋白酶活高等優(yōu)點(diǎn)。

        2.6 魚排的兩種添加方式對(duì)蛋白水解率的影響

        根據(jù)GB 18186—2000,醬油中氨基酸態(tài)氮含量是醬油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的體現(xiàn),蛋白水解率可直觀的反應(yīng)出原料的利用率,銨鹽是醬油安全品質(zhì)的一個(gè)重要體現(xiàn)之一,銨鹽過(guò)高,影響人的肝、腎功能,誘發(fā)心臟病,增加患癌的危險(xiǎn)[10,11]。本試驗(yàn)以豆粕為主要氮源,進(jìn)行制曲作為對(duì)照組。通過(guò)氨基酸態(tài)氮含量,蛋白水解率及銨鹽含量來(lái)比較魚排和豆粕混合制曲以豆粕制曲魚排后期添加兩種發(fā)酵工藝之間的差異。

        由圖7可知,在發(fā)酵10~15d時(shí),豆制曲醬醪(對(duì)照組)和魚、豆混合制曲醬醪中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到較優(yōu)值,分別為2.50%(干基)和3.80%(干基)左右;魚排在發(fā)酵期添加,則醬醪中氨基酸態(tài)氮在10~15d 時(shí)達(dá)到較優(yōu)值,含量為2.78%(干基)左右;魚排在成曲制備階段加入和發(fā)酵階段加入相比,前者的醬醪中氨基酸態(tài)氮比后者顯著提高,說(shuō)明魚排適合在成曲制備階段添加,且魚排適當(dāng)替換一定比例的豆粕,可有效增加發(fā)酵醬醪的氨基酸態(tài)氮含量。

        由圖8可知,魚、豆混合制曲醬醪和豆制曲醬醪(對(duì)照組)在發(fā)酵10~15d時(shí),蛋白水解率達(dá)到較高值分別為58%和45%左右;魚后期添加在發(fā)酵10~15d時(shí),醬醪蛋白水解率達(dá)最大值52%;由上可知魚、豆混合制曲醬醪比魚后期添加醬醪具有更好的原料利用率。由圖5、6可知,魚、豆混合制曲和豆制曲蛋白酶活差異不大,而魚、豆混合制曲醬醪比豆制曲醬醪的蛋白水解率高,說(shuō)明在同樣酶系酶活條件下魚肉蛋白比豆粕蛋白更容易水解。

        圖7 3種發(fā)酵工藝中氨基酸態(tài)氮隨時(shí)間的變化Figure7 Amino acid nitrogen changes over time in the three kinds of fermentation process

        圖8 3種發(fā)酵工藝中蛋白水解率隨時(shí)間的變化Figure8 Protein hydrolysis efficiency changes over time in the three kinds of fermentation process

        圖9 3種發(fā)酵工藝中銨鹽隨時(shí)間的變化Figure9 Ammonium salt changes over time in the three kinds of fermentation process

        由圖9可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的推移,銨鹽先增加后減少,這是由于發(fā)酵過(guò)程中微生物的脫氨基作用及蛋白水解過(guò)程[10]中產(chǎn)生的小分子氨使得醬醪中銨鹽增加,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),由于采用中溫發(fā)酵,在溫度較高的情況下銨鹽會(huì)分解揮發(fā)從而下降[12]。在3種發(fā)酵工藝中,豆制曲醬醪中銨鹽為最低,魚、豆混合制曲醬醪比魚排后期添加醬醪銨鹽要低,由此可知魚肉蛋白的添加會(huì)滋生腐敗菌,從而增加了銨鹽的含量,但是魚、豆混合制曲與豆制曲相差不大,是生產(chǎn)魚醬油比較衛(wèi)生安全的一種發(fā)酵方式。然而魚排后期添加采用加曲發(fā)酵方式的醬醪銨鹽含量較高,故很多研究者進(jìn)行加曲發(fā)酵時(shí),一般采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵的方式[8,13],從而抑制腐敗菌的滋生。

        3 結(jié)論

        羅非魚魚排蛋白含量高達(dá)36%(干基計(jì))與豆粕接近,可作為蛋白質(zhì)原料制備魚露或復(fù)合發(fā)酵制品。魚排在成曲制備階段,以一定比例添加到原料中替換一部分豆粕,會(huì)影響米曲霉的生長(zhǎng)及分泌酶的活力,但在1/3的替代率下,對(duì)米曲霉中性和酸性蛋白酶活力影響不顯著。將魚排與豆粕混合制備復(fù)合發(fā)酵制品,相同添加量下,魚排在成曲制備階段加入,經(jīng)過(guò)低鹽固態(tài)發(fā)酵一段時(shí)間,其醬醪的氨基酸態(tài)氮、蛋白水解率均顯著高于純豆粕氮源醬醪的氨基酸態(tài)氮、蛋白水解率含量,而醬醪中銨鹽,雖比純豆粕的高,但顯著低于魚排后期添加的樣品。綜合比較,說(shuō)明魚排添加可以有效提高發(fā)酵制品的呈味組分氨基酸態(tài)氮,且在成曲制備階段加入為宜。

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