孫坤 李曉林 張皓 張凱 龐珊珊 孫為豪

去氫駱駝蓬堿通過下調(diào)COX?2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲

孫坤 李曉林 張皓 張凱 龐珊珊 孫為豪

目的探討去氫駱駝蓬堿對(duì)人胃癌MKN?45細(xì)胞環(huán)氧化酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）表達(dá)、遷移和侵襲的影響。方法MKN?45細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后加去氫駱駝蓬堿（2、4、8、16、32μg／ml），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組不加藥物，空白組只加培養(yǎng)液不含細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率；western blot法檢測(cè)COX?2表達(dá)；劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞體外遷移和侵襲。結(jié)果去氫駱駝蓬堿劑量依賴性抑制MKN?45細(xì)胞COX?2表達(dá)（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，去氫駱駝蓬堿組MKN?45細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論去氫駱駝蓬堿可能通過下調(diào)COX?2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。

去氫駱駝蓬堿；胃癌；環(huán)氧化酶?2；遷移；侵襲

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率及死亡率一直居高不下。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率及死亡率居各類惡性腫瘤之首［1］。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特性之一，也是惡性腫瘤患者的主要死亡原因。近年來，中草藥及其提取物的抗癌作用越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。駱駝蓬堿是從蒺藜科多年生草本植物駱駝蓬的種子中提取的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用，已成為腫瘤防治研究的熱點(diǎn)［2］。Hamsa等［3］研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿在體外能有效抑制黑色素瘤B16F?10細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，去氫駱駝蓬堿對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響尚不清楚。

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素合成過程中一個(gè)重要的限速酶，已知COX至少有2種同工酶，即環(huán)氧化酶?1（COX?1）和環(huán)氧化酶?2（COX?2）。COX?2是誘導(dǎo)型酶，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)幾乎不表達(dá)或很少表達(dá)，但在胃癌等多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增加。研究表明，過度表達(dá)的COX?2參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并且與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)［4?5］。本研究探討去氫駱駝蓬堿對(duì)人胃癌MKN?45細(xì)胞COX?2表達(dá)、遷移和侵襲的影響，旨在明確去氫駱駝蓬堿的抗腫瘤作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、藥物及主要試劑 人胃腺癌低分化細(xì)胞株MKN?45購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。去氫駱駝蓬堿、3?（4，5二甲基噻唑?2）2，5?二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI?1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibcol BRL公司；兔抗人COX?2多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒為英國(guó)Amersham公司產(chǎn)品；X線膠片為日本柯達(dá)公司產(chǎn)品。Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)Becton Dick?inson公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 去氫駱駝蓬堿的配制 先以DMSO溶解，而后以RPMI?1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不超過0.1%，0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) MKN?45細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU／L青霉素和100 mg／L鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長(zhǎng)。隔天換液，3 d傳代1次。

1.4 MTT法檢測(cè)去氫駱駝蓬堿對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 將傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，低速離心，制成5×107／L的MKN?45單細(xì)胞懸液后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，換無血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h，分組進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)。去氫駱駝蓬堿組藥物終濃度為2、4、8、16μg／ml和32μg／ml；對(duì)照組：不加藥物；空白組：只加培養(yǎng)液不含細(xì)胞。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 h和72 h后每孔加入濃度為5mg／ml的MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，加入DMSO 150μl終止反應(yīng)。將96孔板移入平板震蕩器，避光水平震蕩10min，使MTT結(jié)晶充分溶解。將96孔板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Bio?Rad公司）中，以空白組調(diào)零，波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔的吸光度（A）值（每組設(shè)4個(gè)平行孔，獨(dú)立重復(fù)3次）。細(xì)胞增殖率（%）＝實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值×100%。

1.5 細(xì)胞蛋白提取和western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MKN?45細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，不同濃度去氫駱駝蓬堿（0、4、8、16μg／ml）干預(yù)培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，以100μl細(xì)胞裂解液（PBS內(nèi)含：1% Nonidet P?40，脫氧膽酸鈉5 g／L，SDS 1 g／L，PMSF 0.1 g／L和抑肽酶10mg／L）4℃處理60 min。細(xì)胞裂解物經(jīng)12 000×g 4℃離心20 min后取上清，BCA試劑盒測(cè)定其蛋白濃度。常規(guī)進(jìn)行SDS?PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗（COX?2抗體和GAPDH抗體），4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體為第二抗體。ECL發(fā)光，X線膠片感光。為評(píng)價(jià)COX?2蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用掃描儀（EPSON GT?8000，Seiko公司，日本）掃描western blot膠片，使用NIH Image圖像分析軟件對(duì)蛋白電泳帶的密度進(jìn)行半定量分析。

1.6 劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn) 1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，棄去培養(yǎng)液，無血清RPMI?1640培養(yǎng)液漂洗1次，用滅菌的200μl移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，培養(yǎng)液小心洗去懸浮細(xì)胞，并立即拍照，記為0 h。用無血清培養(yǎng)液漂洗2次，去氫駱駝蓬堿實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為8μg／m l（此藥物濃度對(duì)增殖無明顯影響），對(duì)照組只加入無血清培養(yǎng)液，不含藥物。將6孔板置37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24 h和36 h后置于100倍的相差倒置顯微鏡下拍照。

1.7 Transwell小室基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠用無血清RPMI?1640培養(yǎng)液按1∶1.5稀釋后取100μl，加入Transwell小室的上室中，室溫下干燥1 h，并用無血清RPMI?1640培養(yǎng)液沖洗2次，將小室置入預(yù)先加入750μl含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)；取不同濃度去氫駱駝蓬堿（0、4、8、16μg／m l）作用24 h的MKN?45細(xì)胞，以無血清的RPMI?1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，分別取200μl加入上室內(nèi)，含細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h后取出，以棉簽小心刮除濾膜上面的細(xì)胞，侵襲并黏附到濾膜下的細(xì)胞以甲醇固定，結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)，每張濾膜在光學(xué)顯微鏡（×200）下隨機(jī)取9個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 去氫駱駝蓬堿對(duì)MKN?45細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果表明，隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MKN?45細(xì)胞的增殖率逐漸降低。2、4、8 μg／ml去氫駱駝蓬堿作用24 h及2μg／ml去氫駱駝蓬堿作用48 h，對(duì)MKN?45細(xì)胞增殖抑制作用與對(duì)照組（0μg／ml）作用相同時(shí)間后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 去氫駱駝蓬堿對(duì)MKN?45細(xì)胞COX?2蛋白表達(dá)的影響 western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0μg／m l）相比，不同濃度去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細(xì)胞COX?2蛋白的表達(dá)水平具有劑量依賴性。見表2。

表1 去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細(xì)胞增殖率（±s，%）

表1 去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細(xì)胞增殖率（±s，%）

注：與0μg／ml比較，?P＜0.05，??P＜0.01

去氫駱駝蓬堿用量（μg／m l）24 h細(xì)胞增殖率48 h細(xì)胞增殖率72 h細(xì)胞增殖率0 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 96.83±3.89 89.62±3.12 63.93±3.84??4 91.65±4.62 79.21±4.98?55.09±4.71??8 89.53±6.88 68.73±4.69??36.67±5.08??16 76.01±5.14?52.36±1.93??27.81±2.62??32 65.54±4.28??48.44±2.78??18.48±4.38??2

表2 不同濃度去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細(xì)胞COX?2蛋白表達(dá)（±s）

表2 不同濃度去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細(xì)胞COX?2蛋白表達(dá)（±s）

注：與0μg／ml比較，??P＜0.01

指標(biāo)去氫駱駝蓬堿0μg／ml去氫駱駝蓬堿4μg／m l去氫駱駝蓬堿8μg／ml去氫駱駝蓬堿16μg／m l COX?2（灰度值）999.77±211.46 662.57±110.41 424.00±42.42 271.83±41.38 GAPDH（灰度值）443.33±30.65 466.00±24.66 478.33±17.44 464.00±24.12 COX?2／GAPDH 2.23±0.35 1.43±0.27??0.89±0.11??0.59±0.12??

2.3 去氫駱駝蓬堿對(duì)MKN?45細(xì)胞遷移的影響 在劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過劃痕處理，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，MKN?45細(xì)胞逐漸向痕跡內(nèi)部生長(zhǎng)、遷移，去氫駱駝蓬堿作用后遷移速率較對(duì)照組（0μg／ml）顯著降低，而且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果更加明顯（圖1）。

圖1 去氫駱駝蓬堿對(duì)MKN?45細(xì)胞遷移能力的影響（劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)，×100）

2.4 去氫駱駝蓬堿對(duì)MKN?45細(xì)胞侵襲的影響 Tr?answell小室基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0μg／ml）相比，不同濃度去氫駱駝蓬堿組（4、8、16 μg／ml）均顯著抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力，穿膜細(xì)胞數(shù)隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增加逐漸減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

表3 去氫駱駝蓬堿對(duì)MKN?45細(xì)胞侵襲力的影響

3 討論

3.1 侵襲和轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的重要因素 胃癌是威脅人類生命健康最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的主要原因。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)行為，也是影響治療效果和預(yù)后的重要因素。研究胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制并采取有效的措施進(jìn)行干預(yù)，對(duì)降低胃癌死亡率具有重要意義。侵襲與轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟連續(xù)過程，至少包含以下步驟：原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤，侵襲穿越基底膜并向周圍間質(zhì)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，穿越局部毛細(xì)血管或淋巴管壁進(jìn)入管腔，隨血液或淋巴液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)靶器官，并與該部位的血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘附，穿越管壁和基底膜進(jìn)入周圍間質(zhì)，不斷增殖形成轉(zhuǎn)移瘤。近年來中醫(yī)藥的抗腫瘤、抗侵襲與轉(zhuǎn)移研究備受關(guān)注，已有大量研究表明某些中草藥及其提取物具有抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用［6?9］。本研究在體外觀察了去氫駱駝蓬堿對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，旨在探討去氫駱駝蓬堿的抗侵襲與轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。

3.2 COX?2表達(dá)與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 COX?2在多種胃癌細(xì)胞株內(nèi)高表達(dá)，且對(duì)胃癌細(xì)胞的存活和增殖是必要的［10］。過度表達(dá)的COX?2參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，尤其與胃癌侵襲性密切相關(guān)。目前認(rèn)為，COX?2催化花生四烯酸合成的前列腺素可通過多種途徑增強(qiáng)多種基質(zhì)金屬蛋白酶活性，增加CD44表達(dá)以及降低上皮鈣黏素表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲力［11］。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中COX?2蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位及腫瘤的組織學(xué)類型無關(guān)，與病變的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為反映胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)［12］。據(jù)報(bào)道，應(yīng)用選擇性COX?2抑制劑或基因干擾技術(shù)降低COX?2的表達(dá)，能顯著抑制多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［13?14］。本研究證實(shí)，去氫駱駝蓬堿可有效抑制胃癌細(xì)胞COX?2的表達(dá)。

3.3 去氫駱駝蓬堿抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲 為評(píng)價(jià)去氫駱駝蓬堿對(duì)胃癌MKN?45細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的影響，本研究采用劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)來模擬體外胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的過程。研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿能有效抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，我們推測(cè)去氫駱駝蓬堿可能通過下調(diào)COX?2表達(dá)抑制胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移，為臨床應(yīng)用中藥去氫駱駝蓬堿治療胃癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Harm ine inhibitsm igration and invasion of human gastric cancer cells through down?regulating COX?2 expression

SUN Kun，LIXiao?lin，ZHANG Hao，ZHANGKai，PANG Shan?shan，SUNWei?hao．Department ofGeriatric Gastroen?terology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo investigate the effects of harmine on the expression of cyclooxygenase?2（COX?2），and themigration and invasion of a human gastric cancer cell line，MKN?45.M ethodsMKN?45 cellswere seeded in RPMI?1640 medium supplemented with 10%heat?inactivated fetal calf serum and routinely incubated for 24 h.After treatment with harmine at a final concentration of 2，4，8，16 and 32μg／ml for 24，48 and 72 h，the cell proliferation was deter?mined using MTT colorimetric assay.The expression of COX?2 was detected by western blot analysis.In vitro wound?healing and transwell invasion assayswere used to assess the effects of harmine on themigration and invasion of MKN?45 cells.ResultsHarmine significantly suppressed the expression of COX?2 in a dose?dependentmanner（P＜0.01）.Compared with control group，harmine significantly inhibited migration and invasion of MKN?45 cells（P＜0.01）.ConclusionsThis study demonstrates that harmine inhibitsmigration and invasion of human gastric cancer cells through down?regulating COX?2 expression.

harmine；gastric cancer；cyclooxygenase?2；migration；invasion?

R 735.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.02.008

2013?05?30）

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化科

孫為豪，Email：weihaosun＠hotmail.com