白雪源 邵楓 劉永泉

固有免疫系統(tǒng)Toll?Like受體和炎性小體在炎癥及衰老中的作用

白雪源 邵楓 劉永泉

白雪源 教授

Toll樣受體（Toll?like receptors，TLRs）作為固有免疫系統(tǒng)受體之一，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)天然免疫及誘導(dǎo)獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。炎性小體也是固有免疫的重要組分，能被多種類型的病原體或危險(xiǎn)信號(hào)所激活，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。雖然已經(jīng)提出多種衰老學(xué)說(shuō)如氧化應(yīng)激（oxidative stress）等，但是目前衰老的機(jī)制還不是很清楚［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥與衰老的發(fā)生有關(guān)，但是固有免疫TLRs系統(tǒng)與炎性小體與衰老及其相關(guān)疾病的關(guān)系目前尚不清楚。

1 TLRs的結(jié)構(gòu)、配體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TLRs是人們?cè)谘芯抗壟咛グl(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的dToll基因（dToll）所編碼的一種跨膜受體蛋白，隨后在人類細(xì)胞表面鑒定出與其同源的Toll樣蛋白，并命名為TLRs。TLRs不僅在天然免疫中發(fā)揮重要的作用，而且還可以調(diào)控獲得性免疫反應(yīng)（adaptive immunity）。

1.1 TLRs的結(jié)構(gòu) TLRs分子均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成，屬Ⅱ型跨膜受體。其胞外區(qū)均有18～31個(gè)富含亮氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列（leucine?rich repeat，LRR），該區(qū)為序列多變的Ig樣結(jié)構(gòu)域，與宿主對(duì)感染反應(yīng)的特異性有關(guān)，其空間結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化就會(huì)影響TLRs對(duì)病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pat?tern，PAMP）的識(shí)別。TLRs的胞內(nèi)區(qū)含有Toll／IL?1受體同源區(qū)（Toll／IL?1 receptor homologous region，TIR），其中包括3個(gè)保守盒（con?served boxes），參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［18］。TIR是一保守結(jié)構(gòu)，TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的許多蛋白質(zhì)，如髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、白介素?1（IL?1）受體相關(guān)蛋白激酶（IL?1 receptor?associated kinase，IRAK）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor?associated factor 6，TRAF6）等都具有TIR。

1.2 TLRs的分布、配體 TLRs在生物界高度保守、分布廣泛，但不同生物TLRs的種類和數(shù)量不盡相同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物TLRs有13個(gè)成員，其家族成員主要表達(dá)于各種免疫相關(guān)的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。

TLRs屬于模式識(shí)別受體（pattern cognition receptors，PRRs），能識(shí)別結(jié)合PAMPs。PAMPs包括革蘭陰性菌的脂多糖（lipopolysac?charide，LPS），革蘭陽(yáng)性菌的肽聚糖、脂磷壁酸、磷壁酸，分枝桿菌的脂糖，真菌的甘露聚糖，病毒的RNA、表面蛋白，革蘭陽(yáng)性菌、分枝桿菌、螺旋體中的脂蛋白，細(xì)菌鞭毛蛋白，以及一些微生物的CpG DNA、dsRNA、ssRNA。近年的研究發(fā)現(xiàn)，TLRs還可識(shí)別一些內(nèi)源性配體，這些配體也稱為損傷相關(guān)分子模式（damage?associated molecular patterns，DAMPs），比如熱休克蛋白（HSPs）、細(xì)胞外基質(zhì)的降解產(chǎn)物、自身的核酸成分等。自由脂肪酸和高糖作為TLR2和TLR4的內(nèi)源性配體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎因子（proinflammatory factors）。

1.3 TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MyD88依賴性通路和MyD88非依賴性通路。MyD88依賴性通路是指當(dāng)TLRs胞外段與相應(yīng)配體結(jié)合后，TIR即發(fā)生二聚化并與MyD88的Toll結(jié)構(gòu)域結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)MyD88的死亡結(jié)構(gòu)域活化而形成TIR?MyD88活性復(fù)合體；MyD88用它的死亡結(jié)構(gòu)域募集下游同樣含死亡結(jié)構(gòu)域的I?RAK1和IRAK2，導(dǎo)致IRAK自身磷酸化；磷酸化的IRAK脫離MyD88，與TRAF6結(jié)合，導(dǎo)致TRAF6活化，并引起絲裂原激活蛋白激酶（mito?gen?activated protein kinase，MAPK）家族成員NK（NF?κB?inducing ki?nase）磷酸化，NK活化后激活κB抑制劑激酶（inhibitior of kappa B kinase，IKK），導(dǎo)致κB抑制劑（in?hibitior of kappa B，IκB）泛素化而從IκB／核因子κB（nuclear factor kappa B，NF?κB）復(fù)合物中釋放出來(lái)，NF?κB由此活化并轉(zhuǎn)位入核，從而激活一系列促炎因子基因的表達(dá)。MyD88非依賴性通路，包括TLR3和TLR4。TLR3的MyD88非依賴信號(hào)通路是通過(guò)誘導(dǎo)TRIF（Toll／IL?1 domain containing adaptor protein inducing IFN?β）激活TANK（TRAF joint NF?κB kinase）結(jié)合激酶1（TANK?binding kinase 1，TBK1），進(jìn)而促進(jìn)干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的激活，誘導(dǎo)干擾素β等基因的表達(dá)。TLR4除了參與MyD88依賴性通路之外，還參與MyD88非依賴性通路，它可能主要調(diào)控TLR4介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的成熟和獲得性免疫正向調(diào)節(jié)分子，如主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）、共刺激分子CD80。

1.4 炎性小體的結(jié)構(gòu)與功能 炎性小體（inflammasome）也稱炎癥小體，分子量約700 kD，由Tschopp研究小組于2002年首次提出［2］。它是由胞漿內(nèi)PRRs參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它能夠識(shí)別PAMPs或者宿主細(xì)胞自身的DAMPs，招募和激活促炎癥蛋白酶caspase?1?；罨腸aspase?1切割I(lǐng)L?1β和IL?18前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟炎癥因子。其還能調(diào)節(jié)caspase?1依賴的炎癥壞死，誘導(dǎo)細(xì)胞在炎性和應(yīng)激的病理?xiàng)l件下死亡。目前已經(jīng)確定多種炎性小體參與了針對(duì)多種病原體的宿主防御反應(yīng)，病原體也已經(jīng)進(jìn)化出多種相應(yīng)的機(jī)制來(lái)抑制炎性小體的活化。

目前已發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要有4種，即NLRP1炎性小體、NLRP3炎性小體、IPAF炎性小體和AIM2炎性小體。已知發(fā)現(xiàn)的炎性小體一般均含有凋亡相關(guān)微粒蛋白（apop?tosis?associated speck?like protein containing CARD，ASC）、caspase蛋白酶以及一種NOD樣受體（NOD?like receptor，NLR）家族蛋白（如NLRP1）或HIN200家族蛋白（如AIM2）。

其中NLRP3炎性小體作為固有免疫的重要組分，能被多種類型的病原體或內(nèi)源性損傷分子所激活，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，包括最初被確認(rèn)的家族性周期性自身炎癥反應(yīng)、2型糖尿病、阿爾茨海默病和動(dòng)脈粥樣硬化癥等。NLRP3炎性小體在抵抗流感病毒感染中也起重要作用。NLRP3、ASC和caspase?1缺陷的小鼠在流感病毒感染時(shí)呼吸道炎癥明顯削弱且死亡率顯著提高。流感病毒感染的NLRP3和caspase?1缺陷型小鼠IL?1β和IL?18的分泌也顯著降低。與野生型小鼠相比，NLRP3缺陷小鼠肺泡內(nèi)有大量的膠原沉淀物，并表現(xiàn)出嚴(yán)重的上皮細(xì)胞壞死和呼吸衰竭，提示NLRP3炎性小體在感染后的組織修復(fù)中發(fā)揮作用。此外，NLRP3炎性小體的活化在誘導(dǎo)適應(yīng)性抗病毒免疫中也發(fā)揮重要作用［19］。

2 TLRs信號(hào)通路與衰老的關(guān)系

衰老可以導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生［3］。TLRs作為天然免疫系統(tǒng)受體之一，在誘導(dǎo)天然免疫及獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。但是目前對(duì)TLRs系統(tǒng)在腎臟器官衰老中的作用尚不清楚。我們應(yīng)用免疫印跡（western blot）和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT?PCR）技術(shù)首次系統(tǒng)性地分析了3月齡組（青年組）、12月齡組（中年組）和24月齡組（老年組）大鼠腎臟中TLRs系統(tǒng)分子、NF?κB信號(hào)通路分子IκBα，NF?κB與Phospho?NF?κB（活化的磷酸化NF?κB）以及炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF?α和IL?12b的表達(dá)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腎臟衰老過(guò)程中TLR1、2、3、4、5、11及TLRs信號(hào)通路下游分子MyD88的表達(dá)水平顯著升高。進(jìn)一步研究顯示在衰老腎臟中NF?κB信號(hào)通路分子IκBα、NF?κB與Phospho?NF?κB表達(dá)明顯升高，炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF?α和IL?12b的表達(dá)明顯上調(diào)。表明TLRs系統(tǒng)可能通過(guò)激活NF?κB信號(hào)通路、促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)而在腎臟衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用［20］。

循環(huán)炎癥細(xì)胞因子水平的增加是衰老的重要因素，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。但是，血管細(xì)胞在衰老誘導(dǎo)的慢性炎癥中的作用目前尚不明確。Song等［3］采用western blot、qRT?PCR和ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）分析了青年組（2～4月）和老年組（16～18月）小鼠主動(dòng)脈在非刺激狀態(tài)下的炎癥反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)衰老主動(dòng)脈中IL?6基礎(chǔ)水平升高，衰老的大動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）分泌更多的基礎(chǔ)IL?6。已發(fā)現(xiàn)在衰老的VSMC中趨化因子（如CCL2）、黏附分子（如intracellular adhesion molecule 1，ICAM?1）、固有免疫受體（如TLR4）表達(dá)上調(diào)。他們還分析了衰老TL4?／?和Myd88?／?小鼠的VSMC，發(fā)現(xiàn)TLR4及其信號(hào)分子MyD88與衰老時(shí)IL?6表達(dá)增加密切相關(guān)。TLRs不僅由微生物所激活，也可被內(nèi)源性配體如透明質(zhì)酸或被氧化的LDL等所激活［4］。

與衰老組織器官中TLRs表達(dá)情況不同的是，在老年人血液細(xì)胞中TLRs的表達(dá)基本呈下降趨勢(shì)，而在衰老猴血液中TLR的表達(dá)卻是多種多樣的。Van Duin等［5?6］發(fā)現(xiàn)，在人的外周血單核細(xì)胞中，TLR1的表達(dá)在老年人中下降了36%，而TLR2不受影響，同時(shí)老年人中通過(guò)TLR1／2復(fù)合物所產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少。有研究認(rèn)為，老年人的TLR功能是受損傷的，或者在特定狀態(tài)下有非正常的持續(xù)激活的TLR［7］。Panda等［8］發(fā)現(xiàn)，pDCs中的TLR1／2，TLR2／6，TLR3，TLR5和TLR8復(fù)合物及pDCs中的TLR7和TLR9在衰老人群中均顯著下降。有人研究恒河猴后發(fā)現(xiàn)，一方面，TLR4、TLR2／6和TLR7／9在衰老mDCs中下降，另一方面，TLR4和TLR5在外周單核細(xì)胞中年輕者卻較衰老者有顯著下降［9］。

3 炎癥系統(tǒng)（IKK?NF?κB與炎癥因子、炎性小體）與衰老的關(guān)系

近年研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體出現(xiàn)一種全身性、慢性、低水平炎癥反應(yīng)狀態(tài)。炎性衰老是機(jī)體衰老速率和壽命的一個(gè)決定因素，也是多種慢性疾病發(fā)生的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素。老年個(gè)體出現(xiàn)持續(xù)低度的炎性衰老現(xiàn)象，與機(jī)體物理因素及生理因素變化有關(guān)［10］。比如衰老過(guò)程中，自身抗原清除不夠或延遲、解剖屏障的改變、氧化壓力增加以及蛋白翻譯后修飾的改變等［11］。

炎癥作為細(xì)胞衰老及機(jī)體老化的伴隨反應(yīng)，在維持和促進(jìn)衰老過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。目前，炎性衰老的機(jī)制主要有應(yīng)激學(xué)說(shuō)和細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)。應(yīng)激學(xué)說(shuō)認(rèn)為，衰老過(guò)程中機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激原微環(huán)境中，持續(xù)過(guò)度的應(yīng)激反應(yīng)引起的促炎癥反應(yīng)狀態(tài)可導(dǎo)致炎性衰老［12］。細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)認(rèn)為促炎細(xì)胞因子（如IL?15等）在炎性衰老發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著核心作用［10］。有研究認(rèn)為，衰老過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子如TNF?α、IL?β以及IL?6等的長(zhǎng)期刺激可導(dǎo)致慢性、低度、微炎性的炎性衰老狀態(tài)，從而引起或增加衰老相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生［13］。

炎癥與許多衰老相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、腫瘤、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、癡呆、血管病變、肥胖和代謝綜合征等［11］。目前廣泛認(rèn)為長(zhǎng)期慢性低水平炎癥在代謝性疾病的啟動(dòng)及進(jìn)展中均發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NF?κB信號(hào)通路在代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［14］。炎癥與老年人腫瘤的發(fā)生涉及內(nèi)源性和外源性通路，內(nèi)源性通路中，TNF?α可以激活NF?κB，而NF?κB在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移方面有極其重要的作用；外源性通路中，如CD4＋T細(xì)胞通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶?9（MMP?9）在癌前病變期加速了新生血管的形成及細(xì)胞不典型增生，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［15］。惡性腫瘤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存、增殖和侵襲來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

IKK通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一條非常重要的信號(hào)通路。IKK由 IKKα和IKKβ兩個(gè)催化亞基，及IKKγ一個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成。細(xì)胞表面的各種受體如TLR?4、TNF?γ及IL?1R等均可與相應(yīng)的配體結(jié)合，激活該信號(hào)通路，活化后的IKK通過(guò)激活NF?κB介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有關(guān)IKK信號(hào)通路在炎性衰老過(guò)程中的作用正越來(lái)越受到重視。Deng等［16］發(fā)現(xiàn)，老齡小鼠CD4＋T細(xì)胞中IKKβ的表達(dá)及活性均比青年組高，衰老CD4＋T細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子增多。

最近有關(guān)炎性小體的研究證實(shí)，炎癥與衰老過(guò)程中的功能衰退呈因果關(guān)系。NLRP3炎性小體作為一種特異的傳感器，是衰老過(guò)程中炎癥驅(qū)動(dòng)的功能喪失（如胰島素抵抗、骨質(zhì)流失和認(rèn)知能力下降）的一個(gè)共同觸發(fā)因子。炎性小體隨年齡增長(zhǎng)激活了炎癥反應(yīng)。喂給正常飲食的無(wú)病小鼠形成小鼠的正常衰老過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫傳感器NlRP3炎性小體響應(yīng)衰老而激活。隨后又對(duì)小鼠進(jìn)行了測(cè)試，以確定NLRP3炎性小體活性下降是否減少了炎癥反應(yīng)以及衰老相關(guān)的功能衰退。結(jié)果表明，NLRP3炎性小體較低水平激活的小鼠可以免于老年癡呆、骨質(zhì)流失、葡萄糖耐受不良、白內(nèi)障和胸腺退化等許多衰老相關(guān)疾病。在功能上這些小鼠也表現(xiàn)得更好，不那么虛弱，能夠跑更長(zhǎng)的時(shí)間［17］?，F(xiàn)在關(guān)于固有免疫TLRs的研究越來(lái)越多，而炎性小體作為固有免疫的重要組分，它們參與了許多疾病的發(fā)病過(guò)程［18?20］。目前已經(jīng)公認(rèn)衰老與炎癥相關(guān)，但TLRs及炎性小體在衰老及衰老相關(guān)疾病中的作用有待進(jìn)一步的深入研究。

［1］ CaiW，He JC，Zhu L，et al.Oral glycotoxins determine the effects ofcalorie restriction on oxidant stress，age?related diseases，and lifespan［J］.Am JPathol，2008，173（2）：327?336.

［2］ Martinon F，Burns K，Tschopp J. The inflammasome：amolecular plat?form triggering activation of inflam?matory caspases and processing of proIL?beta［J］.Molec Cell，2002，10（2）：417?426.

［3］ Song Y，Shen H，Schenten D，et al. Aging enhances the basal production of IL?6 and CCL2 in vascular smooth muscle cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（1）：103?109.

［4］ Shirali AC，Goldstein DR.Tracking the toll of kidney disease［J］.JAm Soci Nephrol，2008，19（8）：1444?1450.

［5］ Van Duin D，Mohanty S，Thomas V，et al.Age?associated defect in human TLR?1／2 function［J］.J Im?munol，2007，178（2）：970?975.

［6］ Van Duin D，Shaw AC.Toll?like re?ceptors in older adults［J］.J Am Geria Soci，2007，55（9）：1438?1444.

［7］ Shaw AC，Panda A，JoshiSR，etal. Dysregulation of human Toll?like re?ceptor function in aging［J］.Ageing Res Rev，2011，10（3）：346?353.

［8］ Panda A，Qian F，Mohanty S，et al. Age?associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine re?sponse［J］.J Immuol，2010，184（5）：2518?2527.

［9］ Asquith M，Haberthur K，Brown M，et al.Age?dependent changes in innate immune phenotype and function in rhesus macaques（Macaca mulatta）［J］.Pathobiol Aging Age Relat Dis，2012，Epub 2012 Jun 15.

［10］Lutz CT，Quinn LS.Sarcopenia，o?besity，and natural killer cell immune senescence in aging：altered cytokine levels as a common mecha?nism［J］.Aging，2012，4（8）：535?546.

［11］Chung HY，Cesari M，Anton S，et al.Molecular inflammation：under?pinnings ofaging and age?related dis?eases［J］.Ageing Res Rev，2009，8（1）：18?30.

［12］Cornelius C，Perrotta R，Graziano A，et al.Stress responses，vitagenes and hormesis as critical determinants in aging and longevity：Mitochondria as a“chi”［J］.Immun Ageing，2013，10（1）：15.

［13］Franceschi C，Bonafe M，Valensin S，et al.Inflamm?aging.An evolu?tionary perspective on immunosenes? cence［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，908：244?254.

［14］Baker RG，Hayden MS，Ghosh S. NF?kappaB，inflammation，and met?abolic disease［J］.Cellmetabolism，2011，13（1）：11?22.

［15］Mantovani A.Cancer：Inflaming me?tastasis［J］.Nature，2009，457（7225）：36?37.

［16］Deng H，Mao G，Zhang J，et al. IKK antagonizes activation?induced cell death of CD4＋T cells in aged mice via inhibition of JNK activation［J］.Molec Immunol，2010，48（1／3）：287?293.

［17］Youm YH，Grant RW，Mccabe LR，et al.Canonical Nlrp3 inflammasome links systemic low?grade inflammation to functional decline in aging［J］. Cell Metab，2013，18（4）：519?532.

［18］李麗燕.Toll樣受體的研究進(jìn)展［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（3）：467?469.

［19］雷國(guó)偉，毛立明，李華，等.炎癥小體在對(duì)抗微生物感染中的作用［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（12）：1301?1315.

［20］邵楓，白雪源，陳香美.Toll樣受體受體系統(tǒng)在腎臟衰老中的作用［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（14）：11?14.

R 339.38

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.02.005

2013?12?10）

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2011CBA01003，2011CB964904）

100853北京市，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腎病科，腎臟疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白雪源，邵楓）；101100北京市，北京市通州區(qū)潞河醫(yī)院腎內(nèi)科（劉永泉）