楊 波，肖春宏

(臨滄師范高等專科學(xué)校數(shù)理系，云南 臨滄 677000)

嗜鹽菌 (Halophiles)指在高鹽條件下生長的細(xì)菌，它主要生長在鹽湖、鹽堿湖、鹽沼、死海和鹽場等環(huán)境中，我國的嗜鹽菌資源十分豐富。在微生物中，盡管放線菌為人類的醫(yī)療保健事業(yè)做出了巨大的貢獻，但目前從普通土壤環(huán)境放線菌中發(fā)現(xiàn)新化合物的可能性已經(jīng)越來越小，難度也越來越大［1］。而在不同生態(tài)環(huán)境，特別是嚴(yán)苛或極端環(huán)境中生存的放線菌，在進化過程中很可能變異形成新的代謝控制基因和代謝途徑［2］，生成新化合物的可能性比較大。截止2000年，在已發(fā)現(xiàn)的微生物來源的大約16000多種生理活性物質(zhì)中，有70%以上是放線菌產(chǎn)生的［3］。因此，如果我們以過去未曾研究的特殊放線菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)新的有用化學(xué)結(jié)構(gòu)的機會將會是較大的，尤其是那些生存于極端環(huán)境中的放線菌將是可以廣泛利用的天然產(chǎn)物源泉［4—5］?；诖?，本文對一株鹽湖嗜鹽放線菌的次生代謝產(chǎn)物進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

放線菌 (YIM70085T)從我國新疆艾比鹽湖分離純化獲得，該菌株歸屬于閻氏菌屬 (Yania屬)。

1.2 培養(yǎng)基

甘油0.4%;天門冬酰胺0.1%;麥芽膏0.8%;酵母膏0.3%;蛋白胨0.9%;大豆粉2.8%;KH2PO40.1%;微量鹽溶液0.1%(V/V);KCl 10%;pH=7.2～7.4。

1.3 主要儀器

三足式高速離心機 (上海);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (BUCHI公司);BS－100A自動部分收集儀(上海青浦瀘西儀器廠);Waters515－2996分析型高效液相色譜儀 (美國Waters公司);Lc－8A制備型高效液相色譜儀 (日本島津公司);真空冷凍干燥儀 (Labconco 195，UK);VG Auto Spec－3000型質(zhì)譜儀;Bruker AV.DRX500核磁共振儀;AVATAR360F－IR紅外測定儀;德國Vario EL有機元素分析儀;熔點儀。

1.4 發(fā)酵粗提物的制備流程

對YIM70085T菌株進行固體和液體發(fā)酵后收集發(fā)酵上清液粗提物、菌絲體粗體物和固體發(fā)酵粗提物，采用普通硅膠G柱層析進行初步分離，然后進行純化。其中對固體發(fā)酵粗提物進行分離提純后共得到2個化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵樣品所得純品的HPLC圖譜

2.1.1 化合物1的HPLC圖譜和紫外吸收圖譜 (見圖1)

圖1 化合物1 HPLC圖譜和紫外吸收圖譜Fig.1 HPLC chart and scan chart of full wave band by ultraviolet absorption of compound 1

2.1.2 化合物2的HPLC圖譜和紫外吸收圖譜 (見圖2)

圖2 化合物2 HPLC圖譜和紫外吸收圖譜Fig.2 HPLC chart and scan chart of full wave band by ultraviolet absorption of compound 2

2.2 化合物結(jié)構(gòu)解析

質(zhì)譜、核磁共振波譜、紅外光譜和紫外光譜等波譜方法已被廣泛用于有機化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，從這些方法得到的各種相互補充的結(jié)構(gòu)信息為有機物結(jié)構(gòu)鑒定提供了可靠的依據(jù)。本文中所得到的化合物在核磁共振、質(zhì)譜及元素分析等數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，并參考DNP數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)解析。

2.2.1 化合物1結(jié)構(gòu)初步解析結(jié)果

化合物1結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 化合物1結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The structure of compound 1

圖4 化合物1的HMBC相關(guān)圖Fig.4 The HMBC correlation of compound 1

化合物1的1H和13C圖譜數(shù)據(jù) (所用溶劑DMSO)

表1 化合物1的1H和13C圖譜數(shù)據(jù) (DMSO)Table 1 The1H and13C spectral data of compound 1 in DMSO

根據(jù)以上分析結(jié)果，得出該化合物的分子式為C8H14N2O2。分子量為170。

2.3 化合物2結(jié)構(gòu)解析初步結(jié)果

化合物2結(jié)構(gòu)示意圖

圖5 化合物2結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The structure of compound 1

圖6 化合物2的HMBC相關(guān)圖Fig.6 The HMBC correlation of compound 2

化合物2的1H和13C圖譜數(shù)據(jù) (所用溶劑DMSO)

表2 化合物2的1H和13C圖譜數(shù)據(jù) (DMSO)Table 2 The1H and13C spectral data of compound 2 in DMSO

根據(jù)以上分析結(jié)果，得出該化合物的分子式為C13H17N3O3。分子量為263。

3 討論

本文所分離純化的YIM70085T固體發(fā)酵粗提物中，共得到2個化合物，經(jīng)DNP數(shù)據(jù)庫檢索，均為已知骨架但取代位置或取代基有異的新化合物，且均為核苷類衍生物。究其原因，可能是由于這種物質(zhì)的量比較大，比較容易析出;而且在各種發(fā)酵粗提物中，菌絲體粗提物的量最大，也許在粗提物的處理過程中，細(xì)胞膜破碎，核苷類物質(zhì)溶解出來，所以所得的化合物大多數(shù)為核苷類衍生物。在醫(yī)療應(yīng)用方面，核苷類似物常用作核酸代謝的抑制劑。

微生物藥物的開發(fā)和研究在整個微生物資源的研究中占有及其重要的地位，分離得到新結(jié)構(gòu)的化合物和有活性的化合物是進行深入研究的基礎(chǔ)。在本次實驗中，運用了微生物的發(fā)酵方法，梯度離心分離法，液相色譜分析法，抑菌活性測定等方法，得到了具有活性的化合物，這些化合物的具體化學(xué)性質(zhì)及藥用價值都還有待進一步研究。因此下一步的工作將是對這些化合物的生物活性進行進一步的檢測。

［1］崔承彬.對我國微生物藥物研究發(fā)展戰(zhàn)略的思考和建議 ［C］.藥物科學(xué)前沿與發(fā)展方向.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2000:92—96.

［2］Miyado.S.Research on antibiotics screening in Japan over the last decade:A production microorganism approach ［J］.Actinomycetologica，1993，7:100—106.

［3］山田晴宙.放線菌分野の話題 ［M］.生物工學(xué)會志，1998.

［4］陳代杰.微生物藥物學(xué) ［M］.上海:華東理工大學(xué)出版社，1999.

［5］H.Z·hner，H.P.Fiedler in fifty years of antimicrobials:Past perspectives and future trends［R］.SGM symposium 53，Cambridge University Press，Cambridge，1995，67—85.