李秀豐，謝美華，李雪玲，楊海艷

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，云南 昆明 650201;3.云南省高校應(yīng)用生物學(xué)重點實驗室，云南 楚雄 675000)

石榴科 (Punicaceae)亦稱安石榴科，全世界共有1屬2種，產(chǎn)于地中海至亞洲西部地區(qū)。我國引入栽培1種，即石榴Punica granatum。石榴在南北各省都有分布，根據(jù)花的顏色以及重瓣或單瓣等特征又分為若干栽培變種［1］。石榴的根、葉、花、果皮、種子均可入藥［2，3］。近年大量研究表明，石榴具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗菌、抗感染等諸多功效，這與石榴中含有較高的抗氧化活性物質(zhì)有關(guān)［4，5］。

然而，石榴干腐病、褐斑病、桃蛀螟、炭疽病、蚜蟲、介殼蟲、吸果夜蛾等病蟲害常造成石榴樹大量落葉，影響樹勢和產(chǎn)量［6］。石榴炭疽病會導(dǎo)致光合作用和吸收代謝受到制約和影響，影響石榴的品質(zhì)，甚至引起植株死亡，造成經(jīng)濟損失。

炭疽病的病原菌主要是刺盤孢菌，刺盤孢寄主范圍非常廣泛，可在多種植物體上繁衍生長，該病具有潛伏性，難以早期診斷、早期防治，因此一旦暴發(fā)流行，很難控制和治愈［7，8］。由于刺盤孢菌有的種寄主廣泛，形態(tài)多變，分類系統(tǒng)復(fù)雜，根據(jù)寄主專化性、形態(tài)學(xué)等特征進(jìn)行種級鑒定對初學(xué)者而言比較困難。近年來，分子技術(shù)在刺盤孢屬內(nèi)種間的鑒定和分類上取得了巨大進(jìn)展，如測定炭疽菌ITS rDNA序列差異、RAPD法、PCR－RFLP法、AFLP法、基因組DNA的AT富集區(qū)分析法等［9］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，刺盤孢菌分類研究中，形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因聯(lián)合分析已成一種趨勢［10—14］。

雖然石榴炭疽病在我國時常報道，但其病原究竟是什么未見記載，故本研究采取形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因聯(lián)合分析，對石榴炭疽病的病原進(jìn)行鑒定，為石榴炭疽病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

取患有炭疽病的石榴果，用組織培養(yǎng)法分離病原菌［15］，采用科赫氏法則確定其病原，菌株編號yn058。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)觀察及鑒定

對患有炭疽病的石榴果進(jìn)行形態(tài)觀察，并記錄其形態(tài)特征。分離得到的純培養(yǎng)物，單孢一代或二代于PDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7d，觀察菌落形態(tài)及生長率、顏色和產(chǎn)孢情況等性狀，同時觀察分生孢子及附著孢的形態(tài)特征并記錄。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

用CTAB法提取真菌基因組DNA，選擇的目的基因分別為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 (internal transcribed spacers，ITS)、β－微管蛋白基因 (β－tubulin gene，TUB2)、3－磷酸甘油脫氫酶基因(glyceraldehydes－3－phoaphate dehydrogenase gene，GPDH)和幾丁質(zhì)合成酶A基因 (chitin synthase A gene，CHS1)進(jìn)行擴增與測序，相應(yīng)的PCR擴增引物見表1。

ITS反應(yīng)體系為 50 μL，包含緩沖液 (10×buffer)4μL;MgCl2(25 mM)4 μL;dNTPs(10 mM)0.8μL;Primer 1(10 pM)2μL;Primer 2(10 pM)2μL;Taq 酶 (5U/μL)0.4μL;模板DNA(20 ng)2μL;ddH2O 34.8 μL。再覆蓋上20μL礦物油，以防蒸干。

TUB2、ACT、CAL反應(yīng)體系為50 μL，共包含緩沖液 (2×buffer)25 μL;dNTPs(2 mM)10μL;Primer 1(10 pM)1 μL;Primer 2(10 pM)1μL;KOD FX Neo酶 (1U/μL)1μL;模板 DNA(20 ng)2μL;ddH2O 10 μL。再覆蓋上20 μL礦物油，以防蒸干。

PCR擴增反應(yīng)程序:ITS、GPDH、CHS1的PCR反應(yīng)程序PCR擴增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán);72℃延伸5 min，4℃保存。TUB2的PCR擴增條件:94℃預(yù)變性2min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸1min，共35個循環(huán);68℃延伸10min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照。

表1 目標(biāo)基因及相應(yīng)的引物Tab.1 Primers used for PCR amplification and DNA sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)結(jié)果

病斑生于石榴的果皮上，不規(guī)則分布，開裂，近圓形，褐色，灰白色。PDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7d后菌落直徑達(dá)26.4mm，生長速率為3.1mm/d。菌絲灰白色，背面黃褐色，培養(yǎng)基不變色，菌落中等高度，絮狀，全緣，培養(yǎng)過程中產(chǎn)生菌核。分生孢子直，單孢，無色，圓柱形，頂端鈍圓，大小為12.3～16.3×6.1～7.3μm，平均值為14.6×6.6μm，長寬比在1.9～2.6之間，平均為2.2。附著孢圓形至近橢圓形，簡單，淡褐色，全緣，大小為5.3～8.7×4.9～5.7μm，平均值為7.1×5.3μm。

圖1 石榴炭疽病病斑和病原菌形態(tài)觀察(注:A＆B:石榴炭疽病斑;C＆D:PDA上菌落形態(tài);E＆F:分生孢子和附著孢)Fig.1 Speckle of anthracnose and pathogen morphological observation(Note:A＆B:spots;C＆D:PDA colony morphology;E＆F:conidia and appressoria)

2.2 PCR產(chǎn)物檢測

圖2 相關(guān)基因擴增產(chǎn)物的檢測(注A:ITS基因;B:GPDH基因;C:TUB基因;D:CHS1基因)Fig.2 Detection for amplification products(note A:ITS genes;B:GPDH genes;C:TUB gene;D:CHS1 gene)

從圖2可以看出，圖A中部分菌株ITS序列擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示，目標(biāo)片段在500—750bp之間;圖B中部分菌株GPDH基因擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示，目的片段在250—300bp之間;圖C中部分菌株TUB基因擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示，目的片段在700—800bp之間;圖D中部分菌株CHS1基因擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示，目的片段在300bp左右。選擇無雜帶、清晰的擴增產(chǎn)物送北京百泰克生物有限公司測序。

2.3 測序結(jié)果

將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast搜索比對，結(jié)果如表2所示。供試菌株的CHS序列與C.citricola的同源性為99%，與C.phyllanthi的同源性為98%，供試菌株的GPDH序列與C.karstii，C.boninense，C.gloesporioides的同源性為99%，供試菌株的ITS系列與C.boninens，C.gloeosporioides和C.trucatum的同源性為99%，供試菌株的T1系列與C.karstii，C.boninense，C.phyllanthi，C.annellatum，C.oncidii的同源性為99%，C.petchii，C.citricolad的同源性為98%，與C.cymbidiicola的同源性為96%，與C.torulosum，C.colombiense，C.novae－zelandiae，C.brassicicol的同源性為95%，與C.parsonsiae的同源性為94%，與C.hippeastri的同源性為93%。

表2 參與多相分析的各種名及相關(guān)系列Table 2 Names and related sequence involved in multi－gene combine analysis

2.4 分子系統(tǒng)樹分析

選取以上同源性較高的序列，將各基因序列以關(guān)尾相接的方式進(jìn)行連接［16］，用MEGAV 4.1中的最大簡約法 (Maximum parsimony)構(gòu)建各基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗，500次重復(fù)。結(jié)果如圖3所示，供試菌株與C.karstii聚為一支，節(jié)點支持率為100%，說明二者親緣關(guān)系近。

圖3 基于ITS、TUB2、GPDH、CHS系列構(gòu)建的MP樹Fig.3 Maxinum parsimony phylograms inferred from combined CHS、GPDH、ITS and TUB2 sequences date

3 討論與結(jié)論

本研究以形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)的方法對石榴炭疽病的病原菌進(jìn)行鑒定。

由于C.karstii的CHS系列缺乏，所以yn058與其同源性無法進(jìn)行比較。yn058的ITS系列與C.boninense，C.gloesporioides同源性最高，但是在GenBank所登錄的序列中，約有四分之三的刺盤孢屬真菌的ITS序列被錯誤定義［18］，Cai將在GenBank中定義為C.gloeosporioides的343條ITS序列與該種和其他種的Epitype的ITS構(gòu)建系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)僅該種的錯誤率就高達(dá)86%以上［19］，楊友聯(lián)在分析殼皮刺盤孢菌時發(fā)現(xiàn)，登錄在GenBank中的該種的ITS序列中有部分極有可能被錯位定義，20株定義為該種的菌株分為了起源上明顯較遠(yuǎn)的4個分枝［17］。說明依據(jù)ITS系列對刺盤孢定種必須慎重對待，形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果將更可靠。多基因系統(tǒng)樹顯示，其與喀斯特刺盤孢親緣關(guān)系最近。楊友聯(lián) (2011)報道Colletotrichum karstii:分生孢子圓柱形，單孢，無色，直，12～19.5×6～7.5 μm。附著孢褐色，球形或棍棒形，邊緣完整，6.5～14.5×4～8.5μm［17］，供試菌株形態(tài)特征與其基本相符。

形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)分析，我們認(rèn)為供試菌株為該菌Colletotrichum karstii，為該菌在石榴科植物上首次報道。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志.52卷第2分冊 ［M］.北京:科學(xué)出版社，1983.

［2］《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編.下冊 ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1978.

［3］江蘇省植物研究所.新華本草綱要.第3冊 ［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990.

［4］苑兆和，招雪晴，尹燕雷，等.石榴植物化學(xué)研究進(jìn)展 ［J］.落葉果樹，2013，45(5):1—6.

［5］姚立華，何國慶，陳啟和.石榴生物活性成分研究進(jìn)展 ［J］.食品科技，2006，11:248—251.

［6］劉曉宇，趙莉.石榴減產(chǎn)的原因分析及綜合防治對策 ［J］.生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，(4):28—29.

［7］王啟玉.王德森.園林、園藝植物的炭疽病 ［J］.農(nóng)村實用科技信息，2010，(7):74.

［8］鄭懷舟.談植物炭疽病 ［J］.植物雜志，2002，(3):42—43.

［9］楊海艷.中國刺盤孢及近似屬鑒定研究 ［D］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［10］Prihastuti H，Cai L，Chen H，et al.Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand ［J］.Fungal Diversity，2009，39:89—109.

［11］Damm U，Woudenberg J H C，Cannon P F，et al.Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts［J］.Fungal Diversity，2009，39:45—87.

［12］Damm U，Cannon P F，Woudenberg J H C，et al.The Colletotrichum acutatum species complex ［J］.Studies in Mycology，2012，73:37—113.

［13］Damm U，Cannon P F，Woudenberg J H C，et al.The Colletotrichum boninense species complex ［J］.Studies in Mycology，2012，73:1—36.

［14］Weir B S，Johnston P R，Damm U.The Colletotrichum gloeosporioides species complex［J］.Studies in Mycology，2012，73:115—180.

［15］方中達(dá).植病研究方法.第三版 ［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，l998.

［16］楊友聯(lián).中國貴州、云南、廣西炭疽菌屬真菌多基因分子系統(tǒng)學(xué)研究［D］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［17］楊友聯(lián)，劉永翔，劉作易.炭疽菌屬真菌分類學(xué)研究進(jìn)展 ［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(1):152—157.

［18］Crouch J A，Clarke B B，Hillman B I.What is the value of ITS sequence data in Colletotrichum systematics and species diagnosis?A case study using the falcate－spored graminicolous Colletotrichum group ［J］.Mycologia，2009b，101(5):648—656.

［19］Cai L，Hyde K D，Taylor P W J，et al.A polyphasic approach for studying Colletotrichum［J］.Fungi diversity，2009，39:183.