羅銳軍， 陸 春， 李紀(jì)兵

(中山大學(xué) 附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510630)

生物膜耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

羅銳軍， 陸 春*， 李紀(jì)兵

(中山大學(xué) 附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510630)

生物膜形成是微生物耐藥的重要原因之一，也是許多慢性感染性疾病反復(fù)發(fā)作和難以治療的主要原因，微生物生物膜可以通過滲透限制，改變生物膜內(nèi)外微環(huán)境，形成特殊的基因型等多種方式導(dǎo)致耐藥。生物膜耐藥機(jī)制的研究已成為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、微生物學(xué)等眾多領(lǐng)域關(guān)注的課題。就生物膜耐藥機(jī)制的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

生物膜；耐藥機(jī)制

生物膜(Biofilm，BF)是指微生物在生長過程中附著于物體表面形成的由微生物的細(xì)胞及其分泌的聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)所組成的多細(xì)胞復(fù)合體[1]。生物膜由多種有機(jī)物組成，包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、褐藻酸、腐質(zhì)等，主要成分是多糖和蛋白質(zhì)[2]。生物膜在自然界中很常見，輸水系統(tǒng)、食品加工、航運(yùn)等領(lǐng)域都可見到微生物生物膜的影響。研究表明，大多數(shù)微生物，如細(xì)菌、真菌、支原體等都可以形成生物膜，微生物形成生物膜后，其生物學(xué)特性可發(fā)生改變，包括營養(yǎng)代謝、生長率等，其中最主要的是耐藥性的改變。目前生物膜引起的微生物耐藥明顯增加，約65%的人類感染與生物膜有關(guān)[3]，更有學(xué)者認(rèn)為超過80%的人類感染中有生物膜的形成[4]。本文就一些常見微生物生物膜形成可能的耐藥機(jī)制的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 生物膜可能的耐藥機(jī)制

1.1滲透限制學(xué)說

牙周炎和囊性纖維化病人的慢性肺部感染都是我們熟悉的與生物膜形成有關(guān)的疾病[5-6]。即使在免疫功能正常的人體內(nèi)，生物膜介導(dǎo)的感染也很難治愈，易形成慢性感染。Anderl JN等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺酶陰性的肺炎克雷伯菌，對氨芐青霉素的最小抑菌濃度為2 μg/mL，但當(dāng)生成生物膜以后， 5000 μg/mL氨芐青霉素水溶液作用4 h，仍有66%的細(xì)菌存活，這個(gè)劑量可以完全根除游離狀態(tài)的細(xì)菌。當(dāng)細(xì)菌從生物膜中游離出來時(shí)，它們對抗生素又馬上變得敏感起來,由此推測可能是覆蓋在細(xì)菌表面的生物膜構(gòu)成的外部屏障，限制或減緩了抗生素的滲入，使生物膜中的細(xì)菌逃離了宿主免疫反應(yīng)，抵抗抗菌素的藥物作用[8-9]。另有研究者[10]利用微量液基稀釋法測定22株曲霉游離孢子對兩性霉素B的敏感性，同時(shí)建立22株曲霉生物膜的體外模型，用抗真菌藥物敏感試驗(yàn)聯(lián)合甲基四氮鹽(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-((phenylamino)carbonyl)-2H-tetrazolium hydroxide,XTT)減低法來評(píng)價(jià)曲霉生物膜對兩性霉素B的敏感性，結(jié)果顯示，對曲霉游離孢子，兩性霉素B的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)范圍是0.5～2 μg/mL，對于曲霉生物膜，兩性霉素B的SMIC50(亞最低抑菌濃度50)和SMIC80(亞最低抑菌濃度80)范圍分別是2～>32 μg/mL和8～>32 μg/mL，與游離的孢子相比，曲霉生物膜對兩性霉素B的敏感性明顯下降。生物膜的屏障作用除了物理屏障之外，還存在電荷屏障,Hoiby N等[11]研究表明，氨基糖苷類抗生素因帶有正電荷,易被生物膜中帶有負(fù)電荷的藻酸鹽復(fù)合物吸引而阻止其滲透,且固定在BF基質(zhì)中的抗生素水解酶可滅活進(jìn)入被膜的抗生素，從而使耐藥性大大增強(qiáng)。

1.2營養(yǎng)限制和生物膜內(nèi)外環(huán)境不均一學(xué)說

Leung CY等[12]在研究抗微生物藥物在微生物游離階段、附著階段、生物膜形成階段的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌和念珠菌在游離階段對標(biāo)準(zhǔn)劑量的藥物濃度反應(yīng)敏感，在附著階段和生物膜形成階段對藥物的敏感性降低，生物膜形成以后，運(yùn)用PCR檢測發(fā)現(xiàn)過氧化物酶1(Superoxide Dismutase-1,SOD1)和過氧化氫酶1 (Catalase-1，CAT1)的表達(dá)量都較前增高，推測大腸埃希菌和白色念珠菌生物膜的耐藥性與高抗氧化能力相關(guān)。另外，生物膜由內(nèi)到外存在一個(gè)營養(yǎng)濃度梯度，De Beer D[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，外界的氧氣在生物膜外部就已經(jīng)被基本消耗，導(dǎo)致生物膜內(nèi)部的細(xì)菌缺氧，這種缺氧的細(xì)菌對抗生素的敏感性顯著下降，抗生素很難殺死生物膜內(nèi)的缺氧細(xì)菌。另一方面，局部酸性代謝產(chǎn)物的積聚，導(dǎo)致生物膜內(nèi)外pH值差距較大，可以直接抵抗抗生素的作用。也有人認(rèn)為，這種營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝廢物的堆積，可以使一部分細(xì)菌處于非增殖狀態(tài)，而抗生素很難殺滅這種處于非增殖期的細(xì)菌[14],比如青霉素這種作用于細(xì)胞壁的抗生素，就只對生長期的細(xì)菌有殺滅作用，而對于靜止期細(xì)菌作用不大。

1.3基因型在生物膜耐藥方面的作用

研究表明，處于生物膜內(nèi)的細(xì)菌與游離的細(xì)菌在基因型上是有所差異的，這種差異主要表現(xiàn)在某些基因表達(dá)量的不同[15]。Garcia-Sanchez S等[16]對白色念珠菌和煙曲霉菌生物膜形成前后做了一個(gè)詳盡的基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)生物膜內(nèi)細(xì)菌某些基因的表達(dá)量高于游離的細(xì)胞。比如說，在煙曲霉菌的多重耐藥中，MDR1、 MDR2、MDR4基因出現(xiàn)上調(diào)，而白色念珠菌多重耐藥菌株，則可發(fā)現(xiàn)MDR1、CDR1、 CDR2等基因的上調(diào)[17]。另外，生物膜的另一個(gè)特性是黏附相關(guān)基因的表達(dá)量增加，ALS1是在白色念珠菌形成生物膜之后最主要的上調(diào)的黏附相關(guān)基因,Garcia-Sanchez S在2004年提出，ALS1在生物膜的形成中有獨(dú)立的作用;Nett JE[18]在2009年觀察到，ALS1基因的表達(dá)在生物膜形成的不同階段有不同的表達(dá)。另外，還有一些與細(xì)胞壁形成有關(guān)的基因的異常表達(dá)和調(diào)節(jié)也參與生物膜的形成，如真菌中編碼β-1,3葡聚糖的FKS1、BGL2和 XOG1等。真菌生物膜導(dǎo)致的耐藥與基因表型密切相關(guān)，在細(xì)菌中也是如此。Uhlich GA等[19]在研究大腸埃希菌血清型O157∶H7菌株生物膜形成后對過氧化氫耐藥時(shí)，選用大腸埃希菌的變異菌株ATCC 43895(EDL933)，用基因敲除的方法敲除katG、ahpC、katE 和katP基因后，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌無論在指數(shù)生長期還是在37℃培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h后，對過氧化氫的耐藥性都小于基因敲除前生物膜內(nèi)的細(xì)菌，并且發(fā)現(xiàn)生物膜內(nèi)細(xì)菌的耐藥性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離的細(xì)菌。盡管基因介導(dǎo)的生物膜耐藥理論涉及微生物的實(shí)質(zhì)，但要以此完全闡述生物膜的耐藥機(jī)制，理論依據(jù)不夠充分，有研究者[20]采用96孔微量培養(yǎng)板進(jìn)行白色念珠菌生物膜的培養(yǎng),用MTT法檢測其對氟康唑的敏感性，并用半定量RT-PCR法測定生物膜形成不同時(shí)期CDR1、CDR2及MDR1基因表達(dá)的差異性，結(jié)果白念珠菌生物膜在較早期(2 h)對氟康唑仍然敏感，隨著白念珠菌生物膜的不斷成熟，其耐藥性不斷增高；CDR1及CDR2基因在生物膜形成的早中期及成熟期的表達(dá)明顯上調(diào)，尤其早期的高表達(dá)更為明顯，而MDR1基因的表達(dá)只在生物膜形成早期有明顯的高表達(dá)，從這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以看出，白念珠菌生物膜的耐藥性隨著其結(jié)構(gòu)的成熟而不斷增高，CDR1、CDR2及MDR1基因在生物膜形成早期有明顯的高表達(dá)，但與生物膜耐藥性的增加并不一致。因此，生物膜的耐藥性可能是多種機(jī)制作用的結(jié)果。

1.4熱休克蛋白對于某些微生物生物膜耐藥的影響

生物膜的耐藥機(jī)制復(fù)雜，不能只用其中一種機(jī)制來解釋。近年來，有人發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在某些微生物生物膜的形成和耐藥方面起一定作用。Nicole Robbins等[21]于2012年闡述了分子伴侶熱休克蛋白90(heat shock protein 90， HSP90)在生物膜的分布和耐藥性方面起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在人類真菌感染的主要病原體白色念珠菌中，HSP90通過穩(wěn)定蛋白磷酸酶和MAPK Mkc1通路使游離真菌產(chǎn)生和維持耐藥。HSP90 還可以通過抑制cAMP-PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)溫度依賴性白色念珠菌的形態(tài)。敲除HSP90相關(guān)基因后，生物膜的生成和成熟較前明顯減少，并且對于臨床上應(yīng)用最多的抗真菌藥—唑類藥物的耐藥性降低。但是HSP90介導(dǎo)生物膜的耐藥機(jī)制在微生物不同的細(xì)胞狀態(tài)中亦有所不同，研究表明HSP90消耗后減少了游離菌中蛋白磷酸酶和MAPK Mkc1的表達(dá)，但生物膜形成后的真菌消耗HSP90后，蛋白磷酸酶和MAPK Mkc1的表達(dá)并沒有減少。另外，HSP90水平下調(diào)后，生物膜矩陣中葡聚糖的水平顯著下降。在大鼠靜脈導(dǎo)管的生物膜感染模型中，減弱HSP90的功能可以使生物膜中真菌對氟康唑的敏感性從不敏感轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨让舾小嵝菘说鞍撞粌H在真菌生物膜耐藥機(jī)制中起重要作用，在其他微生物中也扮演重要角色。Zarankiewicz T等[22]在研究嗜組織菌引起的機(jī)會(huì)性感染中證實(shí)，熱休克蛋白60(heat shock protein 60， HSP60)在嗜組織菌體外生物膜形成及耐藥中起重要作用，在培養(yǎng)基中加入抗HSP60抗體后，生物膜的生長被抑制。熱休克蛋白在生殖道支原體感染中的作用亦有報(bào)導(dǎo)，但其與支原體生物膜形成及耐藥相關(guān)機(jī)制中的作用仍有待研究。

1.5其他可能的生物膜耐藥機(jī)制

除了上述幾種常見的耐藥機(jī)制之外，還有其他可能的機(jī)制。例如，細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)作用，有研究者認(rèn)為，細(xì)菌通過互相傳遞一種胞外低相對分子質(zhì)量的自誘導(dǎo)素(也稱信息素)，調(diào)節(jié)自身的基因表達(dá)，促使其黏附、聚集，進(jìn)而形成完整的生物膜，當(dāng)生物膜內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量過多時(shí)，密度感應(yīng)系統(tǒng)會(huì)使一部分微生物從生物膜表面脫離，導(dǎo)致感染擴(kuò)散或復(fù)發(fā)，引起臨床癥狀[23]。另外有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶也與生物膜的形成和耐藥有一定關(guān)系，在銅綠假單胞菌中，誘導(dǎo)與蛋白酶相關(guān)的PfpI、ClpS和ClpP蛋白突變，可以影響其生物膜的形成[24]。其他的一些耐藥機(jī)制，如分泌相應(yīng)藥物的水解酶，激活微生物的應(yīng)激反應(yīng)，啟動(dòng)微生物對藥物的外排泵系統(tǒng)，對抗機(jī)體的免疫防疫體制等。均參與解釋和完善了微生物生物膜形成后耐藥性的增加。

2 展 望

微生物生物膜相關(guān)感染復(fù)雜難治，是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果，生物膜的形成作為微生物的一種生存戰(zhàn)略，對藥物耐藥性增加的原因是多方面的，不僅因?yàn)樯锉荒さ奈锢砥琳献饔茫锬?nèi)微環(huán)境的變化，營養(yǎng)成分的改變，不同的基因表型，微生物感應(yīng)系統(tǒng)等都在生物膜的形成和耐藥方面起綜合作用。生物膜耐藥是臨床感染慢性和復(fù)發(fā)的重要原因，它的形成和耐藥機(jī)制的復(fù)雜性決定了生物膜相關(guān)性感染的臨床治療極為困難，所以控制生物膜相關(guān)感染和耐藥顯得尤為重要，相對于其他研究，生物膜研究起步較晚，仍然存在很多問題有待解決，如更確切的耐藥機(jī)制，多種微生物復(fù)合生物膜的特性和治療，生物膜信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的建立等。隨著人們對生物膜研究的深入以及基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等新技術(shù)的問世,生物膜耐藥機(jī)制的研究將不斷完善。

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AdvancedinDrugResistanceMechanismofBio-Membrane

LUO Rui-jun,LU Chun,LI Ji-bing

(3rdAffil.Hosp.ofSunYat-senUniv.,Guangzhou510630)

The formation of bio-membrane (BM) is one of the important reasons for microorganisms to resist drugs,it is also the main reason that many chronic infectious diseases break out repeatedly and difficult to treat.In recent years,there are more and more researches on BM drug resistance mechanism.A variety of ways lead to drug resistance of BM,such as limiting penetration,changing the biofilm internal and external environment and forming a special genotype,etc.The research of BM drug resistance mechanism has become a topic in medicine,pharmacy,microbiology and many other fields.The latest progress in the BM drug resistance mechanism is summarized in this paper.

bio-membrane (BM); drug resistance mechanism

廣東省自然科學(xué)基金(S2011010004709)

羅銳軍 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槠つw病與性病學(xué)。Tel：020-85253017，E-mail：luoruijun28@126.com

* 通訊作者。男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樾圆W(xué)。Tel：020-85253017，E-mail: luliyuan@tom.com

2013-06-05；

2013-06-19

Q939.93；Q73

A

1005-7021(2014)01-0092-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.01.018