盛 潔，哈麗旦，王 平，蔣中英

（1.伊犁師范學院電子與信息工程學院，伊寧835000；2.伊犁師范學院化學與生物科學學院，伊寧835000）

1 引 言

細胞是生命現(xiàn)象的物質結構基礎，其參與物質、能量和信息交換等生命活動.由于真實的細胞膜中各種磷脂和蛋白質等分子的形態(tài)和剛性等復雜因素影響，使實驗上直接研究活細胞存在諸多條件限制和困難.因此，需構筑簡化的模擬生物膜體系以供仿生、載藥和生物傳感器等方面的研究.

囊泡作為兩親性分子形成的封閉雙層結構，其物理性質及對外界刺激和響應接近真實細胞.其中巨囊泡 （giant unilamellar vesicles，簡記為GUVs）具有粒徑大 （10～200μm）、利于普通顯微鏡觀測和實施微操作等優(yōu)點.被用于細胞膜間相互作用［1］、細胞形變模擬［2］、細胞膜與其它物質 的 相 互 作 用［3，4］、藥 物 輸 運［5，6］和 微 觀 可 控 反應［7］等研究.已有的溫柔水化法和超聲法制備的囊泡，存在粒徑小、形狀不規(guī)則以及操作不可控等問題.自1986年，Angelova和Dimitrov提出了一種電制備GUVs的方法，并用透明的氧化銦錫（indium tin oxide，簡記為ITO）導電玻璃代替鉑絲電極制備出GUVs［8］.近幾年，電制備作為獲得GUVs的常用方法，對其有效性的提高和機理的研究逐漸增多.其中，Estes等人采用旋涂法提高了干磷脂膜的均勻度，利用流動艙技術實現(xiàn)了低鹽環(huán)境中電制備GUVs［9］.但基于各種因素 （電場、磷脂、緩沖液和溫度等）的影響，對電制備GUVs還有待更深入和系統(tǒng)的研究.

因此，這里利用顯微鏡原位觀察種類、組份以及濃度不同的干磷脂膜在超純水或蔗糖溶液中電制備GUVs的過程.分析了電場、磷脂、緩沖液和溫度等諸多因素對形成GUVs的影響.該研究完善了電制備GUVs法，詮釋了雙親性磷脂分子自組裝的動力學機理.為生理條件下電制備粒徑大的GUVs懸浮液提供了實驗平臺.

2 實驗部分

2.1 材 料

圖1 DOPC，DPPC，DMPC，DOTAP，DOPS，Ch 和RhB-PE的分子結構式Fig.1 Structure formulas of DOPC，DPPC，DMPC，DOTAP，DOPS，Ch and RhB-PE molecules

磷脂二油酰磷脂酰膽堿 （DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿 （DPPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPC）、二油?；装被?（DOTAP）、二油基磷脂酰絲氨酸 （DOPS）、膽固醇 （Ch）和染色劑 （羅丹明B 磷脂酰乙醇胺，簡記為RhBPE）購 于 美 國Sigma 公 司.DOPC，DPPC，DMPC為電雙性磷脂，DOTAP 和DOPS 分別為正電性與負電性磷脂，分子式如圖1所示.氯仿、甲醇和蔗糖均為國產分析純.實驗用水是經Milli-Q 離子交換凈化系統(tǒng)處理所得的超純水 （ρ ＞18 MΩ×cm）.ITO 導電玻璃購于深圳萊寶高科技股份有限公司，玻璃厚度1.1 mm，方塊電阻

15Ω／sq.

2.2 儀器和電制備裝置

數字合成函數信號發(fā)生器 （SFG-1013，GW INSTEK，臺灣）提供電制備的低頻正弦信號，數字示波器 （GDS-2062，GW INSTEK，臺灣）用于監(jiān)測.顯微鏡熱臺 （HCS60，INSTEC，美國）用于電制備過程中的溫度控制.采用倒置顯微鏡（IX71S8F-3，OLYMPUS，日本）的相差和熒光功能實時觀察電形成過程 （物鏡：10×）.

以兩片ITO 玻璃夾聚四氟乙烯 （PTFE）板，用真空硅脂粘合構成電制備GUVs 的簡易裝置［10］，PTFE板上挖15mm×10mm×1mm 的區(qū)域，如圖2所示.交流 （AC）電場或直流 （DC）電場通過銅線施加于ITO 電極上.

圖2 ITO 電極構成的電制備GUVs的艙室.圖紙未按比例Fig.2 The electroformation chamber machined from two pieces of ITO electrode，the drawing is not to scale

2.3 制備GUVs

處理ITO 電極：先用無水乙醇超聲10 min，再用氯仿／甲醇 （體積比1∶1）溶液超聲10min，最后用甲醇淋洗并氮氣吹干，置于30℃真空干燥箱中至少2h即可.

分別用氯仿和氯仿／甲醇 （體積比為19∶1）作為溶劑，配制實驗用的磷脂成膜液，其中羅丹明含量為0.5mol%.使用涂抹法將2μL 的磷脂溶液均勻涂抹在處理好的ITO 電極上，將其置于真空干燥箱干燥至少2h，以確保膜內有機溶劑完全揮發(fā)，使用高純氮氣回填保護.制備GUVs時，先向反應艙室注入0.1mol／L 的蔗糖溶液或超純水緩沖液，后施加電場，利用顯微鏡實時觀察GUVs的生成過程.

3 結果與討論

3.1 GUVs的形成和原理

緩沖液注入 （0.1mol／L，蔗糖）后，DMPC：DOPC （1：0.25）干膜浮起呈現(xiàn)云片狀，如圖3（A）所示.施加AC （2V，10Hz）電場初期，未引起磷脂膜形態(tài)的明顯變化.當AC 電場持續(xù)作用大約2h后，磷脂膜突然出現(xiàn)密集的突起，并膨脹生成一片粒徑較小的GUVs，如圖3 （B）所示.在電場作用下，GUVs粒徑增大，且相鄰的GUVs融合，大約10min后GUVs的粒徑趨于固定值，如圖3 （C）所示.

圖3 電制備DMPC：DOPC （1：0.25）GUVs.（A）干磷脂膜顯微鏡相差圖像；（B）施加AC （2V，10 Hz）120min后GUVs的相差圖像；（C）130min后GUVs的熒光圖像Fig.3 GUVs prepared from DMPC：DOPC （1：0.25）films.（A）Phase-contrast microscopic image of dry phospholipid films.（B）Phase-contrast microscopic image of the first GUVs formed after 120min，and（C）fluorescence microscopic image of GUVs formed after 130min by AC （2V，10Hz）

緩沖液滲入緊密排列的磷脂分子內，使具有親疏水特性的磷脂分子自組織成磷脂雙層重疊排列，宏觀表現(xiàn)為膜的浮起增厚，如圖4 （A）和（B）所示［11］.此時，磷脂雙層膜受水合力、范德華力、滲透壓、水層擾動和熱擾動等因素的作用.依據磷脂膜形變的基本原理可知，一個或多個因素的變化即可引發(fā)磷脂雙層曲率的改變［12］.由于磷脂分子頭部的電特性，如圖1所示.電雙性的磷脂分子頭部可被視為一對偶極子，在AC 電場中將與電場同頻率振動；帶電的磷脂分子在電場中將受到靜電排斥或吸引.因此，在電制備GUVs時，電場成為誘發(fā)和加速磷脂雙層形變的又一個重要因素［13］.它促使磷脂雙層的分離，并加速磷脂雙層的彎曲、出芽和膨脹，如圖4 （C）所示.磷脂雙層的流動性和相鄰的囊泡可融合為GUVs的形成提供了必要條件，如圖4 （D）所示.值得注意的是，電場參數固定時，GUVs不會無限膨脹，其粒徑終將趨于相對穩(wěn)定值.

圖4 電制備GUVs的原理示意圖.（A）干磷脂膜，（B）水化的磷脂膜，（C）膜形變， （D）Δt后生成的GUVS.E（t）代表電場強度，圖中箭頭指向電場方向Fig.4 The Schematics of electroformation GUVs model for theoretical estimates.（A）dry phospholipid film，（B）hydrated phospholipid film，（C）membrane deformation，（D）generated GUVs after a period of time（Δt）.E（t）represents the electric field intensity，the arrow point electric field direction

實驗表明，在0.1mol／L 的蔗糖溶液和超純水緩沖液中，通過施加AC （10～30 V／cm、3～10Hz）或DC （15 V／cm）控制GUVs的制備.這里列出不同條件下電制備GUVs的統(tǒng)計數據，見表1，對比和分析了各個因素對電制備GUVs的影響.

圖5 不同條件下電制備GUVs的平均粒徑統(tǒng)計圖Fig.5 Statistics showing the average particle diameter of electroformation GUVs under different conditions

3.2 電場對電制備GUVs的影響

電場類型對制備GUVs有影響.同等條件下，例如3.5mg／mL DOTAP氯仿溶液制備的干膜，在超純水中分別用AC 電場和DC 電場制備GUVs.DC電場僅用10min即可使磷脂膜形變并生成GUVs，90min 后即可獲得超大粒徑 （＞100 μm）的GUVs，但其形狀和穩(wěn)定性較差，如圖6（A）所示.用AC （1.5V，10 Hz）替換DC 后，觀察到GUVs壁與AC 電場同頻振動，并且形狀改善；若增大AC 電壓幅值，將出現(xiàn)相鄰GUVs融合及粒徑較大的GUVs破裂等現(xiàn)象.這說明AC 電場對生成的GUVs有力的作用.此外，從表1和圖5可知，DC電場對正電性磷脂的作用比對負電性和電雙性磷脂的作用強烈.

表1 電制備GUVs的參數表Table 1 Parameter list of electroformation GUVs

圖6 電制備的DOTAP GUVs的顯微鏡熒光圖像DC（1.5V）作用：（A）10min，（B）90minFig.6 The fluorescence microscopic images of DOTAP GUVs formed after 10min（A）and 90min（B）by DC （1.5V）

電場的電壓幅值和頻率是影響電制備GUVs的主要因素.實驗表明，電壓越大，電形成過程中致磷脂膜形變所需的時間 （Δt）越短，形成的巨囊泡粒度越寬、形狀和穩(wěn)定性越差；電場頻率越低，粘附在磷脂膜上的GUVs的收縮和擴張的頻率越明顯.通常選用AC （20V／cm、10 Hz）或DC （15V／cm）制備形狀相對穩(wěn)定和粒度分布窄的GUVs.例如0.1 mol／L 蔗糖緩沖液中，DOPC：Ch （1：0.3）GUVs電形成后，若電壓不變，則GUVs粒徑和數量將保持穩(wěn)定狀態(tài)，如圖7（A）所示.若電壓增大，將出現(xiàn)GUVs膨脹、融合、破裂和脫離表面等現(xiàn)象，GUVs粒徑將增大至一個新的穩(wěn)定狀態(tài).當電壓幅值≥40 V／cm時，由于膨脹使囊泡壁結構疏松，導致個別粒徑較大的GUVs瓦解，如圖7 （C）所示.電壓幅值從40V／cm 到100V／cm 增大時，粒徑小的GUVs不易瓦解，個別GUVs脫離磷脂膜表面，如圖7 （D）所示.

圖7 電場強度和溫度影響DOPC：Ch （1：0.3）GUVs的粒徑 分 布 統(tǒng) 計 圖.（A）AC （2 V，10 Hz），20℃；（B）AC （2V，10Hz），35℃； （C）AC （4 V，10Hz），35℃；（D）AC （10V，10Hz），35℃.其中對應的插圖為相差圖像Fig.7 The statistics of particle diameter distribution on DOPC：Ch （1：0.3）GUVs impacted by electric field intensity and temperature.（A）AC （2V，10Hz），20℃；（B）AC （2 V，10 Hz），35℃；（C）AC （4V，10Hz），35℃；（D）AC （10V，10Hz），35℃.The corresponding Illustration is phase-contrast microscopic image

3.3 磷脂膜對電制備GUVs的影響

干磷脂膜的均勻性也是影響GUVs品質的因素之一.緩沖液中，磷脂膜的不均勻區(qū)域被認為是磷脂雙層碎片堆積而成，由于雙層的連續(xù)性差，則更易被外力擾動而水化變形［14］.但由于碎片面積的限制，非均勻區(qū)域易形成粒徑小的GUVs和形狀復雜的囊泡，如圖8所示.因此，制備出均勻的干磷脂膜對電形成品質好的GUVs至關重要.Estes提出的旋涂法可控制轉速制備出一定厚度的均勻磷脂干膜，但此方法操作要求高，樣品耗費量多.這里采用操作簡單和節(jié)省樣品的涂抹法，通過控制磷脂溶液的濃度和涂抹量以及溶劑的種類，可制備出均勻的干磷脂膜.由表1和圖5的可知，以氯仿／甲醇作為溶劑且濃度稍低的磷脂溶液制備的干膜，電制備出的GUVs粒徑大、粒度分布窄且形狀規(guī)則.這表明，強揮發(fā)性的氯仿溶劑易使磷脂溶液快速凝固形成非均勻的膜；含少量甲醇的氯仿磷脂溶液可降低溶劑的揮發(fā)速率，利于形成相對均勻的干膜.

磷脂膜組份對電場導致磷脂膜形變所需的時間（Δt）有較大影響.在相同條件下，即同種緩沖溶液、同種溶劑和相同磷脂濃度制備的干磷脂膜，混合組份的磷脂較單組份磷脂更易在短時間內形成粒徑較大的GUVs，見表1.由于多組份磷脂膜易相分離，在受到外界干擾時，改變膜曲率更容易.實驗顯示，有混合磷脂 （如DPPC：DOPC：Ch）在緩沖液（0.1mol／L 蔗糖）注入反應艙室后，表面立刻水化形變，產生小囊泡、形狀不規(guī)則的GUVs、微管或多室囊泡，如圖8（A）所示.施加AC電場15min后，已水化的不均勻區(qū)域里原來的GUVs粒徑增大且形狀改善，并伴有新的GUVs產生；而磷脂膜均勻的區(qū)域生出GUVs，如圖8 （B）所示.AC 電場作用30 min后即可形成大量窄粒度分部的GUVs，如圖8（C）所示.

圖8 電場對電制備DPPC：DOPC：Ch （1：1：0.3）GUVs的影響.（A）不施加電場時磷脂膜形態(tài)的相差圖像；（B）AC （2 V，10 Hz）作用15 min后生成GUVs的相差圖像；（C）AC （2 V，10 Hz）作用30min后生成GUVs的熒光圖像Fig.8 The influence of electric field on the electroformation of DPPC：DOPC：Ch （1：1：0.3）GUVs.（A）shows phase-contrast microscopic image of phospholipid membrane morphology without electric field；（B）shows phase-contrast microscopic image of GUVs with AC （2 V，10 Hz）after 15min；（C）shows fluorescence microscopic image of GUVs with AC （2 V，10 Hz）after 30min

膽固醇是影響GUVs粒徑的因素之一［15］.由于膽固醇可增大磷脂雙層的剛性，會使磷脂膜不易形變.在相同的電制備條件下，含有膽固醇的GUVs粒徑均比不含膽固醇的要小，如圖5所示.

3.4 其它因素對電制備GUVs的影響

實驗顯示，緩沖液、溫度和襯底表面均對電制備GUVs有影響［13，16］.實驗統(tǒng)計結果表明，在超純水中電制備GUVs用時較短 （Δt ≤1.2h），見表1.在無滲透壓的超純水中更易電制備出GUVs，甚至粒徑＞200μm，缺點是穩(wěn)定性差；而蔗糖溶液（0.1 mol／L）具有滲透壓（95 mOsm／kg）.換言之，外加電場對磷脂雙層間的分離起到了補償滲透壓的作用［17］.有研究表明，生理條件下也可用電制備GUVs，但因為離子強度和滲透壓等原因，形成的GUVs粒徑很小，約15μm 左右［18，19］.

電制備GUVs時，要求實驗溫度至少高于磷脂的相轉變溫度，即磷脂膜處于liquid相或gel／liquid混合相，這利于磷脂雙層的形變.對比圖7中（A）和 （B），不難看出溫度升高利于粒徑大的GUVs形成.

襯底特性也會影響干膜的形貌和電形成過程，這里并未做詳細的研究.

4 總 結

利用電形成方法制備了不同磷脂種類和不同組份的GUVs，并利用顯微鏡觀測電場參數、磷脂種類和組份、磷脂溶液的濃度和溶劑種類、磷脂干膜的品質以及緩沖液對形成GUVs的影響.結果表明，電場加速了磷脂膜的雙層間的分離，電場對溶液的滲透壓起到補償作用.AC 電場比DC電場更有效的調節(jié)GUVs的粒徑、形狀和影響其穩(wěn)定性；電壓增大可使磷脂膜形變時間 （Δt）縮短，GUVs的粒度加寬、形狀和穩(wěn)定性變差；電極表面上吸附的GUVs隨AC 電場同頻擴張和收縮.適量濃度的氯仿／甲醇磷脂成膜液利于制備出均勻干膜.混合組份的磷脂較單組份磷脂膜形變時間 （Δt）更短；膽固醇可抑制GUVs的粒徑.高于磷脂相轉變溫度時，蔗糖溶液中形成的GUVs粒徑較超純水中形成的小，但形狀規(guī)則且狀態(tài)相對穩(wěn)定.

電制備GUVs法具有簡單、可控和利于原位微操作等優(yōu)點.但也存在兩個待解決的技術問題，即GUVs與磷脂膜之間以及GUVs間存在粘連，生理條件下電制備的GUVs的粒徑過小.此研究工作為后續(xù)在生理條件下電制備懸浮的大粒徑GUVs提供了平臺.

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