張瑞華，崔建升，孟素英

(1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018;2.河北省污染防治生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050018)

熒光光譜法具有速度快，取樣量少，選擇性好，靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，利用熒光光譜技術(shù)進(jìn)行分析研究在國(guó)內(nèi)外已有大量的報(bào)道。例如劉小靜等對(duì)三維熒光光譜分析技術(shù)的發(fā)展及其在各領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述與展望［1］。如同生物傳感器檢測(cè)中選擇合適的生物識(shí)別元件，才能提高傳感器的靈敏度和準(zhǔn)確性、延長(zhǎng)傳感器的使用壽命等一樣的原理［2］，熒光分析法中熒光探針的選擇也是非常重要的。迄今為止，關(guān)于熒光傳感器的文獻(xiàn)報(bào)道比較多，但熒光探針的選擇范圍仍相當(dāng)有限［3］。在已報(bào)道的熒光探針?lè)肿又?，有機(jī)染料分子因其強(qiáng)的顏色及熒光特性而備受青睞，常見(jiàn)的有機(jī)染料分子如羅丹明類(lèi)、熒光素、香豆素等。堿性羅丹明類(lèi)染料用于各類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定已有很長(zhǎng)的歷史，因具有價(jià)格便宜、容易修飾及光譜性質(zhì)豐富等特點(diǎn)，成為理想的熒光探針生色團(tuán)，但對(duì)其熒光特性的分析及其應(yīng)用方面的總結(jié)還有些欠缺。本文就此對(duì)羅丹明6G的熒光特性及其在熒光猝滅法中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 羅丹明類(lèi)染料的熒光特性

羅丹明類(lèi)化合物是以氧雜蕙為母體的堿性咕噸染料［4］，由于苯環(huán)間有氧橋相聯(lián)，分子具有剛性平面結(jié)構(gòu)，容易吸收入射光的能量而發(fā)射長(zhǎng)波，從而產(chǎn)生熒光［5］。與其他常用的熒光染料相比，羅丹明類(lèi)熒光染料具有摩爾吸光系數(shù)高、光穩(wěn)定性好、對(duì)pH值不敏感、較寬的波長(zhǎng)范圍及可延伸到可見(jiàn)光區(qū)的吸收和較高的量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)［6］，此外其熒光性質(zhì)可調(diào)控、熒光輻射波長(zhǎng)在可見(jiàn)光區(qū)域熒光檢測(cè)時(shí)背景信號(hào)小等優(yōu)異的光物理和光化學(xué)性能，因此被廣泛應(yīng)用在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、藥理學(xué)、生理學(xué)、環(huán)境化學(xué)、單個(gè)分子檢測(cè)、熒光標(biāo)記、激光染料、熒光探針、信息科學(xué)等方面，是分析化學(xué)和生物醫(yī)藥科學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域中最常用的熒光染料［7－8］。

隨著應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，羅丹明類(lèi)熒光染料的研究發(fā)展迅速且受到了更多的重視［9］。這樣特殊的結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的熒光特性，使羅丹明類(lèi)熒光染料成為化學(xué)和生物分析領(lǐng)域中研究較為廣泛的課題［10］。NOELTING和DZIEWONSKY在1905年首先合成了羅丹明染料［11］。

2 羅丹明6G的熒光特性

羅丹明類(lèi)化合物包括羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明G、羅丹明101、異硫氰酸羅丹明、高氯酸羅丹明6G等［3］。其中羅丹明6G(rhodamine 6G，R6G)是一種水溶性陽(yáng)離子熒光染料，其水溶液在紫外光照射下發(fā)出綠黃色熒光，堿性溶液顯暗綠色熒光，乙醇溶液呈現(xiàn)紅黃色帶綠黃色熒光，被廣泛用于熒光標(biāo)記或定量分析［12］。羅丹明6G分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 羅丹明6G的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of rhodamine 6G

熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率是熒光物質(zhì)的重要發(fā)光參數(shù)。羅丹明6G的熒光壽命在納秒級(jí)［13］，且其熒光壽命隨著濃度的增加而減少，例如在2× 10－4mol/L時(shí)為3.7 ns，當(dāng)羅丹明6G的濃度大于10－2mol/L時(shí)，熒光壽命迅速降低，主要由于能量轉(zhuǎn)移到雙分子羅丹明6G熄滅中心了，熄滅中心的壽命約為(1±0.5)ps［14］，流動(dòng)狀態(tài)下，羅丹明6G的熒光壽命為(4.2±0.2)ns［15］。熒光量子產(chǎn)率是指熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光光子數(shù)的比值，它是衡量熒光物質(zhì)熒光量的尺度，通常情況下其數(shù)值總是小于1，其數(shù)值越大，化合物的熒光越強(qiáng)。熒光量子產(chǎn)率的大小，主要決定于化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，同時(shí)也與化合物所處的環(huán)境因素有關(guān)。在室溫下，KUBIN等研究了在0.5 mol/L的硫酸介質(zhì)中羅丹明類(lèi)化合物的熒光量子產(chǎn)率，其中羅丹明6G的結(jié)果為0.95，顯示了很好的熒光性［16］。WüRTH等用光學(xué)和光聲方法測(cè)定了羅丹明6G的絕對(duì)量子產(chǎn)率，它在乙醇和水溶液中的結(jié)果分別為1±0.06和0.92±0.05，這提供了一個(gè)基本的熒光量子產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)［17］。

羅丹明6G是廣泛應(yīng)用于光學(xué)、光譜學(xué)和激光科學(xué)的有機(jī)染料［18］。1980年，徐其亨對(duì)此類(lèi)染料的結(jié)構(gòu)及其性能進(jìn)行了綜合研究和歸納，認(rèn)為羅丹明類(lèi)染料中苯環(huán)間有“氧橋”相聯(lián)，具有剛性平面結(jié)構(gòu)，容易吸收入射光的能量而發(fā)射長(zhǎng)波，從而產(chǎn)生熒光。另外它本身具有醌式結(jié)構(gòu)，能產(chǎn)生顏色，被氧化時(shí)其醌式結(jié)構(gòu)遭破壞，染料溶液顏色變淺甚至變?yōu)闊o(wú)色，為熒光分析和光度分析奠定了理論基礎(chǔ)［8］。陳尚賢等從改變?nèi)軇┬再|(zhì)，了解R6G是離子型化合物。在有機(jī)溶劑中，分子和離子形式可同時(shí)存在，且其熒光來(lái)源于它的離子態(tài)［19］。ZEHENTBAUER等也研究了8種不同濃度的有 機(jī) 溶 劑 (methanol，ethanol，n-propanol，iso－propanol，n-butanol，n-pentanol，acetone，and dimethyl sulfoxide(DMSO))對(duì)羅丹明6G熒光光譜的影響效應(yīng)［20］;張建華等研究了羅丹明類(lèi)堿性染料溶液的表面張力、吸收光譜和熒光變化，發(fā)現(xiàn)羅丹明類(lèi)堿性染料是一種陽(yáng)離子表面活性劑。羅丹明6G溶液的濃度約為4.48×10－3mol/L時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)膠束，臨界膠束濃度(CMC)值為2.09×10－3mol/L，R6G溶液的濃度小于1.05×10－5mol/L，溶液的熒光最強(qiáng)［21］。到20世紀(jì)80年代后期，又有人對(duì)羅丹明類(lèi)染料的聚集狀態(tài)進(jìn)行了研究，但由于數(shù)學(xué)模型太簡(jiǎn)便，因此所測(cè)定的締合物和締合度都不準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上，何錫文等確立了新的數(shù)學(xué)模型，確定了羅丹明6G的水溶液主要是單體和二聚體共存后，又以羅丹明6G為例，研究了用熒光法估計(jì)熒光試劑在溶液狀態(tài)的締合程度，探討了以解聚的方式來(lái)提高熒光強(qiáng)度的途徑，最后推論:羅丹明6G的單體是產(chǎn)生熒光的主要原因，而雙聚和質(zhì)子化是熒光猝滅的主要影響因素［22］。

3 羅丹明6G在熒光猝滅法中的應(yīng)用

在痕量分析中，熒光分析法因其靈敏度一般高于分光光度法，具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性較好、成本低、易操作、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的重視。在熒光分析中，可以采用不同的試驗(yàn)方法來(lái)對(duì)物質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)量。其中最簡(jiǎn)單的是直接測(cè)定，只要分析物質(zhì)本身發(fā)熒光，便可以通過(guò)測(cè)定其熒光強(qiáng)度以知其濃度。對(duì)于有些物質(zhì)，它們本身不發(fā)熒光或者因熒光量子產(chǎn)率很低而無(wú)法進(jìn)行直接測(cè)定，便只能采用間接測(cè)定的方法。熒光猝滅法便是其中的一種，依據(jù)熒光猝滅的程度與分析物質(zhì)濃度之間的定量關(guān)系，通過(guò)測(cè)定熒光化合物熒光強(qiáng)度下降的程度，便可間接地分析該物質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，熒光猝滅法比直接熒光測(cè)定法更為靈敏，具有更高的選擇性。

自20世紀(jì)80年代初，開(kāi)始研究和利用羅丹明6G的熒光猝滅以來(lái)，有的是基于該物質(zhì)的吸收光譜可以和羅丹明6G的發(fā)射光譜有效重疊，從而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移使熒光猝滅;有的是基于和羅丹明6G染料生成無(wú)熒光的締合物(或絡(luò)合物)，使熒光猝滅;有的是基于該類(lèi)染料的氧化還原性，通過(guò)氧化還原破壞其剛性結(jié)構(gòu)，使熒光猝滅;對(duì)于金屬離子的測(cè)定，是利用待測(cè)金屬離子與R6G試劑反應(yīng)生成配合物或離子締合物，在有機(jī)溶劑中發(fā)出的熒光或試劑本身產(chǎn)生的熒光而進(jìn)行測(cè)定;羅丹明6G還被用于作為檢測(cè)碘化物的光纖傳感器的熒光探針，也是基于碘離子能使羅丹明6G熒光猝滅的原理而建設(shè)起來(lái)的［23］。它在分析化學(xué)上廣泛應(yīng)用于檢測(cè)金屬離子、陽(yáng)離子、陰離子和蛋白質(zhì)等，是一種靈敏度頗高的實(shí)用有機(jī)分析試劑。

3.1 羅丹明6G-共振能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)熒光猝滅法是近年來(lái)發(fā)展的高靈敏度測(cè)定痕量組分的新方法，該方法自20世紀(jì)40年代末提出以來(lái)在化學(xué)、生物以及其他領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。FORSTER能量轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為，當(dāng)能量給予體分子和接受體分子兩者的基態(tài)與第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)間能級(jí)差相當(dāng)，或者能量給予體分子的發(fā)射光譜與能量接受體分子的吸收光譜能有效重疊，可以發(fā)生從能量給予體分子到能量接受體分子的非輻射能量轉(zhuǎn)移［24－25］。

作為一種重要的光物理技術(shù)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移與常規(guī)熒光法和共振光散射相比，具有靈敏度高、適用范圍廣、受環(huán)境因素(如瑞利散射光)干擾少，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。下面將羅丹明6G在能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法中的部分應(yīng)用列表，如表1所示。

3.2 羅丹明6G-雜多酸離子締合物熒光猝滅

近年來(lái)以堿性染料－雜多酸離子締合物為基礎(chǔ)測(cè)定磷、砷、硅，有了迅速發(fā)展。王筱敏等利用在酸性介質(zhì)中磷鉬酸鹽與羅丹明6G形成絡(luò)合物，使羅丹明6G熒光猝滅，來(lái)測(cè)定磷，測(cè)定范圍在0～10×10－9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9%，回收率為96% ～102%［39］;高甲友等研究了在聚乙烯醇(PVA)存在下，砷鉬雜多酸與堿性染料羅丹明6G生成離子締合物，使羅丹明6G熒光猝滅測(cè)定砷，其質(zhì)量濃度在2～60 ng/mL范圍內(nèi)與熒光猝滅值成線性關(guān)系［40］，王燕也利用此方法進(jìn)行了測(cè)定，在最大激發(fā)波長(zhǎng)λmax=580 nm處，砷質(zhì)量濃度在0～0.16 μg/mL范圍內(nèi)符合比爾定律［41］;除此之外宋功武等在這方面做了大量的工作:研究了磷鉬雜多酸測(cè)定磷［42］;硅鉬雜多酸測(cè)定硅［43］、磷、硅鉬雜多酸測(cè)定磷和硅［44］;硅、砷鉬雜多酸同時(shí)測(cè)定硅和砷［45］;還有磷，砷、硅鉬雜多酸體系不需要其他分離手段，用此法可對(duì)鋼合金中的磷、砷、硅進(jìn)行同時(shí)測(cè)定［46］，測(cè)定結(jié)果滿(mǎn)意。此外，宋功武等、滕恩江等高甲友等還在研究雜多酸離子締合物熒光猝滅反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引入流動(dòng)注射，提高了分析速度，測(cè)定了磷［47－50］、硅［51］、砷［52］，以及同時(shí)測(cè)定了磷和硅［53］、磷和砷［54］、砷和硅［55］、磷、砷和硅［56］，取得了良好的效果。

3.3 羅丹明6G-碘化鉀離子締合物熒光猝滅

一般在表面活性劑存在的酸性條件下，有些物質(zhì)可以使碘化鉀中的 I－生成 I3－陰離子，I3－又與R6G形成穩(wěn)定的多元離子締合物，從而使羅丹明6G熒光猝滅。隨著物質(zhì)濃度的增加，生成的I3－陰離子濃度也增加，(R6G－I3)n締合微粒濃度也相應(yīng)增加，體系的熒光猝滅值增加。這是由于R6G+陽(yáng)離子可與I－陰離子通過(guò)離子鍵形成疏水性的R6G－I3離子締合物，并聚集成(R6G－I3)n締合微粒，使得R6G熒光分子被包裹在締合微粒體內(nèi)而不能與激發(fā)光分子作用，導(dǎo)致體系中可以產(chǎn)生熒光的R6G分子數(shù)減少，故體系的熒光降低［57－58］。熒光猝滅值在一定范圍內(nèi)與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，由此建立了一種羅丹明6G熒光猝滅法分析物質(zhì)的新方法。具體的應(yīng)用見(jiàn)表2。

表1 羅丹明6G在能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法中的應(yīng)用Tab.1 Rhodamine 6G in energy transfer fluorescence quenching method application

續(xù)表1

續(xù)表2

4 結(jié)語(yǔ)

羅丹明6G優(yōu)越的熒光特性，使得羅丹明6G熒光猝滅法還可用于很多方面，方法靈敏度高，其選擇性在表面活性劑的存在下也有很大的提高，此外因其形成的絡(luò)合物較差的水溶性，同時(shí)用于絡(luò)合的配體經(jīng)常也會(huì)同其他離子有一定的絡(luò)合能力，使其選擇性降低。綜上所述，如何更深入地研究表面活性劑的作用機(jī)理，尋求更加適用的反應(yīng)體系，設(shè)計(jì)合成具有更好選擇性、較高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)，并可以在環(huán)境和生物體內(nèi)廣泛應(yīng)用的熒光探針還需要我們進(jìn)一步的探索和研究。同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)羅丹明6G熒光猝滅機(jī)理的探討，使羅丹明6G的應(yīng)用更加完整、系統(tǒng)，形成一套具有理論指導(dǎo)的分析方法。相信隨著科學(xué)工作的深入，羅丹明6G在熒光猝滅法中的應(yīng)用會(huì)得到更好的發(fā)展和深入。

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