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        HCCR及其在消化系統(tǒng)腫瘤中的診療價值

        2014-03-19 07:20:56舒婷婷盧啟明王巧麗
        衛(wèi)生職業(yè)教育 2014年22期
        關(guān)鍵詞:反義線粒體區(qū)域

        舒婷婷,盧啟明,王巧麗,馮 婧

        (1.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院,甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000)

        近十年,食管癌、胃癌和結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。消化系統(tǒng)惡性腫瘤已成為危害人類健康最嚴重的腫瘤性疾病,其早期診斷對于及時確定治療方案和延長患者生存期均有重要意義。目前認為,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種基因突變逐漸積累參與的復(fù)雜過程,由于環(huán)境及自身因素引起的多基因的突變,導(dǎo)致正常細胞的增殖、凋亡以及染色體的穩(wěn)定性改變,使腫瘤新生物具有了血管形成、侵襲及向遠處轉(zhuǎn)移的能力[1-2]。因此,了解在腫瘤惡化早期起作用的基因的生物學功能,將會為腫瘤的預(yù)防、診斷提供線索,同時提高癌癥患者的生存率。目前臨床上常見的腫瘤標記物篩查消化系統(tǒng)惡性腫瘤的效果很不理想,容易漏檢及出現(xiàn)假陽性,急需發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性均較高的新腫瘤標記物。人宮頸癌基因(HCCR)是由韓國科學家Ko等[3]發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)的原癌基因,對其功能研究表明,HCCR在早期腫瘤中的表達更明顯,提示HCCR與人類多種惡性腫瘤的早期發(fā)生有關(guān),有可能成為惡性腫瘤基因治療的新靶點,為治療消化系統(tǒng)腫瘤帶來新的曙光。本文就HCCR在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進展做一簡要綜述。

        1 HCCR 及其蛋白結(jié)構(gòu)

        HCCR基因是Ko等[3]用差異顯示RT-PCR法,從原發(fā)子宮頸癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)灶及子宮頸癌細胞系CUMC-6中篩選、鑒定出一段異常表達有206bp的不完全cDNA片段,該片段稱為CC214,其定位于人染色體12q。由于前體mRNA選擇性拼接加工不同,可引起兩種選擇性剪切:HCCR-1和HCCR-2。HCCR-1由9個外顯子構(gòu)成,共編碼360個氨基酸,其編碼的蛋白分子量為42kDa,HCCR-2編碼序列除缺少HCCR-1外顯子(exon1)的部分序列外,其余編碼核苷酸序列與HCCR-1相同,HCCR-2可編碼304個氨基酸,其蛋白分子量為36kDa。這兩個亞型的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)是完全一致的。HCCR-2蛋白是HCCR-1蛋白的拼接變異體,在HCCR-1的258核苷酸區(qū)發(fā)生A與G的替換,造成HCCR-1的異亮氨酸轉(zhuǎn)換為HCCR-2的纈氨酸。NIH/3T3細胞軟瓊脂集落形成試驗和裸鼠成瘤試驗均提示HCCR-2的致癌性比HCCR-1更強。

        2 人類腫瘤發(fā)生的細胞生化機制

        Ko等[4]在2004年構(gòu)建了含有HCCR-2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,其形成的腫瘤表現(xiàn)出上皮癌的特征,在體內(nèi)模擬了HCCR-2強制表達可單獨誘發(fā)乳腺癌及轉(zhuǎn)移灶。但是HCCR同人類腫瘤發(fā)生的細胞和生化機制還不是十分清楚。Cho等[5]對熒光素酶進行活性分析表明,HCCR-1的5'側(cè)翼區(qū)-166到30的基因片段在HCCR-1轉(zhuǎn)錄活性中起著重要作用。經(jīng)過對這個區(qū)域的計算分析確定了兩個位于-26到-4(Tcf1)和-136到-114(Tcf2)的T-細胞因子受體。遷移率變動分析(EMSA)顯示,核蛋白質(zhì)只特異結(jié)合Tcf1區(qū)域,而非Tcf2區(qū)域,突變在Tcf1區(qū)域?qū)е罗D(zhuǎn)錄活性顯著降低。使用熒光素酶和Wnt信號激活阻斷劑GSK-3β(糖原合成酶激酶-3)后,含有Tcf1的野生型構(gòu)建體報告活動顯著增強,但含有Tcf1突變的構(gòu)建體細胞則不被影響。此外,內(nèi)源性HCCR-1的表達也增強。同時還觀察到,轉(zhuǎn)錄因子、Tcf、共刺激因子β-連環(huán)蛋白都結(jié)合Tcf1區(qū)域位點。HCCR-1的Tcf1區(qū)域是一個調(diào)節(jié)HCCR-1的表達和本區(qū)域異常刺激的主要區(qū)域,可誘發(fā)各種癌癥。2007年Cho等[6]又利用生物信息學工具預(yù)測了HCCR-1蛋白的生物特性,并確定了HCCR-1蛋白從75位到346位的氨基酸序列為LETM1同源結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含不同種的線粒體蛋白。熒光顯微鏡和分餾實驗表明,HCCR-1定位在綠猴腎細胞系COS-7、人乳腺癌細胞系MCF-7和人胚腎HEK/293細胞系的線粒體內(nèi)膜。拓撲結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),HCCR-1的NH2末端朝向細胞質(zhì),該D1-2區(qū)即HCCR-1蛋白第1~110位氨基酸序列,是轉(zhuǎn)錄后的線粒體入口,具有線粒體生物學功能。

        3 HCCR-2 與P53

        P53具有“分子警察”的功能,P53蛋白的缺失、突變和失活,在惡性腫瘤的激化演變過程中起著重要的作用[7]。P53蛋白的主要功能包括誘導(dǎo)細胞周期阻滯、修復(fù)DNA損傷和促進細胞凋亡,從而避免受損DNA的堆積、維持基因組的持續(xù)穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)細胞的分化與衰老、抑制腫瘤血管增生等。P53的下游基因主要包括P21、CD95/fas、P53AIP1、pag608、gadd45、MDM2、Bax、Cyclin等[8]。Ko等將轉(zhuǎn)染HCCR的NIH/3T3細胞注入裸鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)有腫瘤形成,而P53蛋白總表達卻未見下降,進一步檢測P53蛋白下游的P21、MDM2、Bax基因的表達,發(fā)現(xiàn)其水平均有所降低,表明P53蛋白總量雖然保持穩(wěn)定,卻不能保持正常功能[4]。楊燕等[9]構(gòu)建表達HCCR小干擾RNA的真核表達質(zhì)粒pRIV2-siHCCR,將其轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞。Westernblot(蛋白質(zhì)印跡法)結(jié)果顯示,HCCR小干擾RNA作用HepG2細胞后,細胞內(nèi)P53蛋白的表達降低,P15蛋白的表達明顯升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平?jīng)]有明顯改變。這也進一步表明HCCR與P53蛋白的關(guān)系不簡單,一般認為它可能與P53的負性調(diào)節(jié)有關(guān),通過使P53表達下降或者失活,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

        4 HCCR 的調(diào)節(jié)機制

        Cho等[10]觀察HCCR-1的5'側(cè)翼區(qū),并確定包括假定性同源結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合位點的HCCR-1啟動子。NIH/3T3(小鼠胚胎成纖維細胞)中HCCR-1啟動子被磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活,此啟動子在K562細胞中也能夠被野生型Akt活化。使用PI3K特異性抑制劑LY294002作用后,HCCR-1的表達下降,并呈劑量依賴性。這些結(jié)果表明,HCCR-1的表達受PI3K/Akt調(diào)節(jié)。張盛等[11]在胰腺癌細胞SW1990中驗證了這一通路。使用表皮生長因子(EGF)處理胰腺癌細胞SW1990,隨著作用時間增加,HCCR表達水平增高。使用PI3K/Akt通路抑制劑后,HCCR表達水平明顯下降。

        Shin等[12-13]研究發(fā)現(xiàn),HCCR-1通過與HCCR-1結(jié)合蛋白-1(HCCRBP-1)作用,直接穩(wěn)定P53的作用,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。最近Ha等[14]又發(fā)現(xiàn)一種新的HCCR-1結(jié)合蛋白HCCRBP-3。HCCRBP-3在多種腫瘤中過度表達,NIH/3T3細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的裸鼠注射HCCRBP-3也能誘發(fā)腫瘤的形成。此外,P53在HCCRBP-3轉(zhuǎn)染的細胞中表現(xiàn)功能障礙并伴隨P21和Bax誘導(dǎo)缺陷。P53的反應(yīng)性元件P21基因啟動子活性被HCCRBP-3以劑量依賴性方式抑制。因此,研究表明HCCRBP-1、HCCRBP-3有助于HCCR-1通過中斷P53功能誘導(dǎo)腫瘤形成。

        Shin等發(fā)現(xiàn)從K562細胞核中提取的蛋白質(zhì)有識別和綁定位于HCCR-1啟動子的Tcf1區(qū)域的野生型特定序列的作用。他們構(gòu)建了數(shù)個HCCR-1的近端啟動子區(qū)域的刪除突變體,用GSK-3β 阻斷劑處理HEK/293和K562細胞后,內(nèi)源性HCCR-1的合成增加。這些發(fā)現(xiàn)表明,HCCR-1啟動子的Tcf1區(qū)域是一個主要調(diào)節(jié)HCCR-1表達的區(qū)域。異常刺激本區(qū)域可能誘發(fā)各種癌癥。

        HCCR通過線粒體激活介導(dǎo)途徑介導(dǎo)細胞凋亡異常參與腫瘤的發(fā)生。體外研究顯示,HCCR-1蛋白是線粒體膜上K/H離子交換泵的重要組分,K/H交換泵的缺陷會引起線粒體腫脹和凋亡,HCCR的過度表達可以引起線粒體生存時間明顯延長,促進腫瘤的發(fā)生[6-15]。

        5 臨床應(yīng)用前景

        目前,惡性消化系統(tǒng)腫瘤臨床進展快、患者生存期短,傳統(tǒng)臨床治療的中遠期療效不理想,因而尋找新的腫瘤治療方法是全球臨床及科研工作者所面臨的問題。通過cDNA陣列比較雜交法(comparativehybridizationofcDNAarrays)、RT-PCR和Northerm印跡雜交等方法分析肝癌及癌旁組織中的基因表達水平。結(jié)果顯示,HCCR在肝癌組織中高表達,但在癌旁組織中不表達[16-17]。HCCR這種在腫瘤組織中高選擇性表達的特點,使得靶向HCCR的基因治療能夠精確定位于癌變組織,有效破壞癌變細胞特有的生存機制,誘導(dǎo)細胞凋亡,降低腫瘤的生長潛能。因此,以HCCR為靶點的各種治療技術(shù)有望成為臨床腫瘤治療新的切入點。目前的研究主要集中在RNA干擾(RNAi)技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)、抗體制備技術(shù)這幾方面。

        RNA干擾是通過短雙鏈RNA與mRNA中的同源序列結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物,誘導(dǎo)靶基因降解,進而高效特異性阻斷目的基因表達的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的技術(shù)。姜琳等[18]研究食管癌EC9706細胞HCCR-2的siRNA轉(zhuǎn)染細胞,下調(diào)HCCR-2蛋白及mRNA的表達,觀察到細胞凋亡增加,細胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯,P53下游基因P21與P27的表達增加。

        反義寡核苷酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補原理,用人工合成或設(shè)計目標DNA或mRNA的序列片段,從而抑制或封閉目標靶基因表達和功能發(fā)揮的基因封閉技術(shù)。劉安定等[19]構(gòu)建了pcDNA3.1-HCCR反義真核表達質(zhì)粒,利用反義RNA技術(shù)轉(zhuǎn)染HepG2細胞,RT-PCR檢測顯示HCCRmRNA表達降低。轉(zhuǎn)染后24小時HCCRmRNA水平下降到16%,其蛋白表達水平在24小時也明顯降低。對細胞的增殖與凋亡活性檢測顯示:轉(zhuǎn)染HCCR反義質(zhì)粒后,HepG2細胞增殖受到抑制,轉(zhuǎn)染后24小時抑制率為47.62%,細胞凋亡率為14.34%±0.91%,細胞分裂多停止在G0、G1期。這些結(jié)果表明,可以以HCCR為靶點進行基因?qū)耄瑥亩M一步增強癌癥的治療效果,遏制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

        國內(nèi)張曉勇等[20-22]致力于制備HCCR重組蛋白和單克隆抗體的研究。耿東進等[21]在細菌中制備了HCCR-1和HCCR-2蛋白質(zhì),其分泌抗體效價高且均能特異識別重組蛋白,為建立新的早期診斷方法和開發(fā)腫瘤疫苗奠定了可靠基礎(chǔ)。

        6 展望

        隨著對HCCR機制和功能的理解不斷加深,我們逐漸意識到其對于人類惡性腫瘤預(yù)防與治療的重要性。早期測定HCCR的水平,不但可以篩選出具有惡性轉(zhuǎn)化可能的高危病變,便于及早進行預(yù)防和采取治療措施,而且將HCCR應(yīng)用于制備腫瘤疫苗,也會給腫瘤的治療帶來新的契機[23-24]。對于這種基因,其自身激活、致癌機制以及與其他分子的相互作用等還有許多問題尚未研究清楚,我們還需要更多前瞻性的臨床研究來測試和驗證。

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