魯立柱/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 王燕平/新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司制藥事業(yè)部

豬瘟活疫苗（兔源）組織毒生產(chǎn)及其貯存方法比較研究

魯立柱/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 王燕平/新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司制藥事業(yè)部

我國自1956年開始推廣豬瘟兔化弱毒疫苗時(shí)，首先是取家兔的淋巴結(jié)和脾組織就地制造的濕苗， 隨制隨用。1958年研制成功冷凍干燥疫苗，適用于工廠化生產(chǎn)，時(shí)至今日仍然采用相同的生產(chǎn)工藝，豬瘟脾淋苗以其抗原性好，過敏率低，免疫后快速產(chǎn)生免疫力等優(yōu)點(diǎn)深受廣大養(yǎng)殖戶的喜愛，但其組織毒生產(chǎn)工藝繁瑣，人員工作量大，綜合成本高等諸多缺點(diǎn)也限制了其產(chǎn)量。通過對生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，從降低測溫次數(shù)、提高組織收獲量、增加組織保存期限三方面著手，降低生產(chǎn)成本，提高組織毒生產(chǎn)安排的靈活性，以達(dá)到保證產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)上有效提高疫苗產(chǎn)量的目的。

一、材料與方法

1. 材料。豬瘟病毒：豬瘟兔化弱毒，F(xiàn)0代豬瘟兔化弱毒（C株）凍干種毒購自中國獸藥監(jiān)察所提供；脾淋組織毒由本公司豬瘟生產(chǎn)組提供。試劑：注射用水，由本廠制水站提供；滅菌生理鹽水、Hank's液、5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護(hù)劑等自行配制，消毒后備用。實(shí)驗(yàn)動物：體重為2.0～2.5 kg健康的純系加利福尼亞兔，未注射過兔瘟疫苗，基礎(chǔ)體溫應(yīng)在39.3℃～39.7℃之間，且波動小于0.5℃，由新疆鄯善縣綠洲兔業(yè)養(yǎng)殖場提供。

2.方法。

（1）生產(chǎn)病毒最佳接種量和收毒部位的確定方法。先將凍干毒種用滅菌生理鹽水制成50倍稀釋的乳劑，耳靜脈注射家兔6只，每只1 ml。注射后按照規(guī)程規(guī)定的效力檢驗(yàn)方法，選取熱型反應(yīng)為定型熱的家兔3只，在溫度下降后24 h內(nèi)剖殺，以無菌手術(shù)采取家兔肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)，采毒時(shí)切勿剪破胃、腸、食道，以免污染。然后，將收獲的組織分別碾磨，用滅菌生理鹽水稀釋成1×10-4、2×10-4、3×10-4兔體感染量/克的乳劑，耳靜脈注射家兔2只，每只1 ml，按照規(guī)程規(guī)定的效力檢驗(yàn)方法判定家兔熱型。

（2）組織毒使用不同保護(hù)劑在不同溫度下的保存期試驗(yàn)方法。將制備的兔瘟組織毒，稱重，研磨，平均分成四份，分別使用滅菌生理鹽水、Hank's液、5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護(hù)劑制備成10倍稀釋的乳劑。再以2.0×10-4兔體感染量/克作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將各組試驗(yàn)樣用滅菌生理鹽水稀釋成2.0×10-4兔體感染量/克的乳劑，各組試驗(yàn)樣分別置于-70℃、-15℃、2℃～8℃環(huán)境貯存，于7日、30日、60日、90日、120日、150日分別耳靜脈注射家兔2只，每只1ml。按照規(guī)程規(guī)定的效力檢驗(yàn)方法判定熱型反應(yīng)，檢查各試驗(yàn)樣的基礎(chǔ)病毒含量是否≤2.0×10-4兔體感染量/克。

二、結(jié)果

1．脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)組織生產(chǎn)病毒的收率比較。實(shí)驗(yàn)兔脾臟平均重量在2～3 g，在腹腔內(nèi)胃大彎部，易于收獲，且無其它組織粘連，收獲中也不易產(chǎn)生污染，各方面條件都適用于組織苗的生產(chǎn)。肝臟質(zhì)量大，平均在80～120 g是脾臟的2～40倍，而且收獲容易，不易造成污染，重量大是其最大的優(yōu)勢，腸系膜淋巴結(jié)在腹腔內(nèi)腸系膜中心位置，其平均重量在4～5 g，被大量脂肪組織包圍，收獲時(shí)不易剝離，不小心容易剪破腸道造成污染。頜下淋巴結(jié)位于皮膚與下頜骨之間，平均重量為0.3～0.5 g，體積過小收獲時(shí)不易剝離，而且在宰殺兔子時(shí)，放血過程中容易切破此部位造成污染。表略

2.各組織不同稀釋度熱型反應(yīng)判定結(jié)果。按照規(guī)程效力檢驗(yàn)的方法，檢測脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)的病毒含量，經(jīng)熱型判斷，結(jié)果良好，達(dá)到了生產(chǎn)要求的配苗標(biāo)準(zhǔn)，脾臟病毒含量最高，腸系膜淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)稍低于脾臟，肝臟的病毒含量未達(dá)到生產(chǎn)配苗的要求。表略

3.各種保護(hù)劑保存的組織毒在不同溫度下保存7日、30日、60日、90日、120日、150日后的病毒含量保持情況。根據(jù)病毒含量測定結(jié)果，生理鹽水和Hank’s液保存的組織，只有在-70℃時(shí)能夠維持組織病毒含量到150日以上。-15℃保存組織，生理鹽水保存的組織病毒含量會迅速降低，Hank’s保存的組織病毒含量可以維持到60日，仍能達(dá)到配苗要求。豬瘟耐熱保護(hù)劑和5%蔗糖脫脂牛奶保存的組織病毒在冷凍保存下，保存時(shí)間能夠到達(dá)150 d以上。2℃～8℃冷藏保存，5%蔗糖脫脂牛奶保存的組織在第7日時(shí)病毒含量就已經(jīng)不符合配苗要求了，豬瘟耐熱保護(hù)劑保存的組織可以維持到120 d以上。表略

4.四種保護(hù)劑優(yōu)缺點(diǎn)對比。對四種保護(hù)劑從保存效果和經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性方面對比分析，5%蔗糖脫脂牛奶，最適合在生產(chǎn)中使用，生理鹽水和Hank's液雖然經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，操作方便，對配苗影響也不大，對組織毒的保存效果不理想，不能達(dá)到長期保存組織毒的目的，豬瘟耐熱保護(hù)劑，對組織病毒含量保存的很好，但價(jià)格較高，且容易凝固影響配苗，所以在生產(chǎn)中不便于使用，5%蔗糖脫脂牛奶，保存效果良好，其本身就是凍干保護(hù)劑，對于產(chǎn)品后期配苗凍干過程無影響。表略

三、討論

豬瘟活疫苗(兔源)生產(chǎn)使用的組織毒，是熱型判定為定型熱反應(yīng)和輕熱反應(yīng)的家兔的脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，組織毒配苗要求是每頭份疫苗組織含量不得少于0.01 g。每只家兔能夠收獲的組織量在7～8 g，按照配苗要求，每只家兔只能產(chǎn)出700～800頭份疫苗。如果提高家兔的組織收獲量，就能夠提高疫苗的產(chǎn)量。脾臟和腸系膜淋巴結(jié)重量是有限的，不可能有太多的改變，因此發(fā)現(xiàn)和收取其它含毒組織是提高收獲量的唯一途徑。從結(jié)果可以看出脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)都出現(xiàn)了較好的熱型反應(yīng)，達(dá)到了配苗要求。肝臟雖然重量較大，但病毒含量較低，未出現(xiàn)明顯的熱型反應(yīng)，不能用于生產(chǎn)，頜下淋巴結(jié)的熱型反應(yīng)達(dá)到了配苗要求，可以作為生產(chǎn)用組織毒，一定程度上達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。但頜下淋巴結(jié)重量較小，收獲困難且容易造成污染，在大生產(chǎn)中為了收取這極少的一部分組織而冒著整批產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)，有些得不償失。所以綜上所述，脾臟和腸系膜淋巴結(jié)仍以病毒含量高，無菌收獲操作簡單等優(yōu)點(diǎn)列為豬瘟活疫苗（兔源）生產(chǎn)的最佳組織原料。

根據(jù)生產(chǎn)要求，組織毒病毒含量≤2×10-4/克，方可用于配苗，豬瘟活疫苗（兔源）生產(chǎn)規(guī)程要求，新鮮組織毒存放時(shí)間不得超過15日。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出四種保護(hù)劑保存的組織毒，存放在-70℃的，至150日都可以達(dá)到有效的病毒含量，-15℃保存的組織毒中，生理鹽水組和Hank's液組在90日時(shí)病毒含量測定熱型不合格，已經(jīng)不能用于配苗。2～8℃保存的組織毒，除耐熱保護(hù)劑組一直到120日仍然保持有效病毒含量外，其余三組于7日時(shí)病毒含量就已經(jīng)不合格了。

分析以上結(jié)果，無論采取以上那種保護(hù)劑，貯存在-70℃的組織毒都能存放150日以上而不影響病毒含量，但在-70℃保存，限制性較大，成本高，不適于大生產(chǎn)使用，對于生產(chǎn)與檢驗(yàn)用種毒應(yīng)該是十分理想的保存溫度。

-15℃是生產(chǎn)冷庫普遍能夠達(dá)到的溫度，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，使用5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護(hù)劑的組織毒，在此環(huán)境下都能保存到150日以上且不影響病毒含量。豬瘟耐熱保護(hù)劑保存組織雖然在2～8℃環(huán)境下保存150日以上，但使用耐熱保護(hù)劑，成本較高，且耐熱保護(hù)劑內(nèi)含有明膠，冷藏保存容易使組織在容器內(nèi)結(jié)成整塊，不便于后期配苗使用，所以使用豬瘟耐熱保護(hù)劑，雖然能取得很好的保存效果，但生產(chǎn)中運(yùn)用難度較大。

綜上所述使用5%蔗糖脫脂牛奶，在-15℃以下保存組織毒，在生產(chǎn)中應(yīng)用，能取得最理想的效果，大大延長組織毒的保存時(shí)間。

略