李尤艷，肖智

(1.遵義醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2013級；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563003)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是多種病因?qū)е碌拇x性疾病，患者胰島素分泌不足和/或靶細(xì)胞對胰島素缺乏反應(yīng)，引起三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，表現(xiàn)為血糖升高及尿糖，晚期出現(xiàn)多器官的病理性改變、功能障礙甚至衰竭同時伴有“三多一少”的臨床癥狀。下丘腦是較高級的內(nèi)臟活動調(diào)節(jié)中樞，它通過垂體將神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)活動聯(lián)系起來，調(diào)節(jié)著體溫、攝食、飲水、日節(jié)律、情緒反應(yīng)等。下丘腦包含多個神經(jīng)核團(tuán)，其中弓狀核(arcuate nucleus，ARC)位于下丘腦結(jié)節(jié)區(qū)室周帶內(nèi)，參與對垂體功能、自主神經(jīng)功能、神經(jīng)免疫以及疼痛等的調(diào)制[1]。以往對ARC神經(jīng)元電生理特性的研究多采用在體和離體多細(xì)胞記錄的方法，由于對ARC單個神經(jīng)元電生理特性的闡明對了解其在能量代謝中的調(diào)節(jié)功能非常重要，因此在本研究中將采用腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對單個ARC神經(jīng)元進(jìn)行研究。臨床及基礎(chǔ)研究均證實：中醫(yī)針刺療法對糖尿病及其慢性并發(fā)癥均具有較好的干預(yù)作用，不僅可以降低患者的血糖水平而且對糖尿病胰島素抵抗具有抑制作用[2]，但對其機制不清楚。本研究通過對1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)大鼠行外周穴位電針(electroacupuncture，EA)刺激，觀察其ARC神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率的變化，以明確電針對T1DM的治療作用及其相關(guān)的中樞機制，為中醫(yī)治療糖尿病提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠32只，體重200～210 g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。隨機分成4組，每組8只，分別為正常對照組、糖尿病組(DM組)、糖尿病電針治療組(DM+EA組)和糖尿病假電針治療組(DM+假EA組)。

1.2 動物模型的建立

DM組、DM+EA組和DM+假EA組大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ )建立1型糖尿病大鼠模型。具體方法如下：新鮮配制STZ溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH4.2，按60 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射；3 d后采集大鼠尾靜脈血測血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖陽性(+++)為DM建模成功的大鼠；DM建模大鼠出現(xiàn)死亡，將重新建模補足每組大鼠數(shù)目。正常組SD大鼠禁食不禁水12 h后僅腹腔注射等量的無菌枸櫞酸緩沖液。實驗期間以上各組動物自由飲食飲水，常規(guī)鼠飼料。

1.3 血糖測定

測定空腹血糖：葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(glucose oxidase-peroxidase，GOD-POD)法，按試劑盒說明書(北京華宇億康生物工程技術(shù)有限公司)提供方法進(jìn)行操作。

1.4 電針方法

采用LH-800 韓式穴位神經(jīng)刺激儀(北京航天航空大學(xué))(直徑0.4 mm)進(jìn)針約4 mm， 連接穴位神經(jīng)刺激儀，陽極接足三里(ST 36)，陰極接三陰交(SP 6)，ST 36和SP 6形成一個電流環(huán)路。電針部位及參數(shù)選擇：根據(jù)文獻(xiàn)[3]選取電針穴位以及根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選取電針刺激參數(shù)：“疏密波”，密波頻率100 Hz(波寬0.2 ms)；疏波頻率2 Hz(波寬0.6 ms)，電流強度0.5-1.0-1.5 mA遞增，每個強度維持10 min。DM大鼠在建模成功后第2天開始穴位電針，1次/2 d，連續(xù)7次。

1.5 膜片鉗檢測

1.5.1 試劑 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，aCSF)的配制：ACSF中各種離子成份及其濃度(mmol/L)為：NaCl 126，KCl 5，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.25，NaHCO326，葡萄糖10，用稀鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。室溫下，在上述溶液中通以(95%O2+5%CO2)混合氣30 min以上，使其達(dá)到飽和。電極內(nèi)液的配制：電極內(nèi)液的離子成分及其濃度(mmol/L)為：葡萄糖酸鉀145，MgCl22，K2ATP 5，EGTA 0.5，HEPES 6，Na3GTP 0.25，用稀鹽酸或氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，275～285 mosM。將配制的電極內(nèi)液過濾分裝，迅速放到-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 弓狀核腦片的制備 根據(jù)文獻(xiàn)方法制備下丘腦腦片[4]，大鼠在乙醚麻醉下快速斷頭取腦，置入0～5 ℃混合氣飽和的aCSF中，60 s后取出修塊，把修好的組織塊固定在振動切片機(美國自然基因有限公司)標(biāo)本托上，用振動切片機沿下丘腦冠狀面切成厚約400 μm的薄片，通過與大鼠腦圖譜[5]比對，選取包含ARC的切片。全部腦片置于混合氣飽和的aCSF中室溫(20～24 ℃)下孵育120 min以上備用。

1.5.3 腦片固定、灌流與給藥 將腦片置于灌流槽內(nèi)，腦片浸沒于液面下1～2 mm，蓋網(wǎng)輕壓于腦片上。使用恒流泵持續(xù)向腦片浴槽灌注混合氣飽和的加熱(33 ℃)aCSF。

1.5.4 膜片鉗記錄 ①記錄電極的制備：玻璃微電極采用軟質(zhì)中性無芯玻璃管(直徑1.2 mm，長10 cm，美國SUTTER公司)，應(yīng)用P-97微電極拉制儀(美國SUTTER公司)用五步拉制而成。拉制好的電極尖端直徑約1～2 μm，灌入電極內(nèi)液后阻抗為6～8 MΩ。② 細(xì)胞封接：實驗在20～30 ℃室溫下進(jìn)行。微電極充灌適量的電極內(nèi)液后，與Ag/AgCl電極絲構(gòu)成回路，通過電極夾持器與放大器的探頭相連。在倒置顯微鏡選取ARC腹內(nèi)側(cè)區(qū)的神經(jīng)元，下先將選好的細(xì)胞移至視野的中間，再用定向推進(jìn)器將電極尖端緩慢靠近細(xì)胞。封接細(xì)胞，當(dāng)電極與胞膜之間的電阻增大至吉歐姆(109Ω)水平以上時破膜，形成“全細(xì)胞膜片”(whole-cell patch)。實驗過程中灌流槽中通以混合氣(95%O2+5%CO2)飽和的aCSF灌流，調(diào)節(jié)流速(約2 mL/min)，使槽內(nèi)液體在1 min內(nèi)完全更新。③信號記錄：膜片鉗放大器(Axopatch 700B，美國Axon公司)采集的電流或電壓信號，經(jīng)Digidata 1440A/D轉(zhuǎn)換器(美國Axon公司)接口進(jìn)入計算機，通過膜片鉗專用軟件Clampex10.2程序采樣錄入，采樣頻率為10 KHz，濾波頻率為1～5 KHz。在Clampex采樣程序下形成全細(xì)胞記錄模式，然后在電流鉗下通過記錄電極給以一系列由超極化到去極化的躍階電流(-60～+140 pA，step=20 pA，時長200 ms)刺激，觀察膜電位對刺激的反應(yīng)情況。在電流鉗下能夠誘發(fā)出動作電位的細(xì)胞被認(rèn)為是狀態(tài)良好的神經(jīng)元。記錄各實驗組大鼠ARC腦片神經(jīng)元放電頻率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠給予電針刺激前后的一般表現(xiàn)

STZ注射建模成功后，DM大鼠逐漸出現(xiàn)程度不同的多食、多飲、尿量增多、活動減少以及消瘦，精神不振，體毛缺乏光澤等。經(jīng)過多次外周穴位電針刺激后，DM大鼠“三多一少”的癥狀明顯緩解。

2.2 電針刺激前后各組大鼠空腹血糖水平變化

檢測空腹DM建模大鼠，其尾靜脈血測血糖濃度≥16.7 mmol/L，符合糖尿病大鼠診斷標(biāo)準(zhǔn)。DM+EA組大鼠在給予外周穴位電針后，其空腹血糖水平下降，和DM組大鼠比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；DM+假EA組大鼠在給予外周穴位電針后空腹血糖水平與DM大鼠比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 電針對DM大鼠空腹血糖的影響(mmol/L)

*P<0.01，與同時間點正常組比較；△P<0.01，與同時間點DM組比較。

2.3 ARC神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率

各組大鼠ARC神經(jīng)元于制片后6 h內(nèi)進(jìn)行膜片鉗記錄，以狀態(tài)良好的ARC神經(jīng)元為實驗對象。ARC神經(jīng)元的直徑約10～35 μm，為中型卵圓或多角形細(xì)胞，有2～4個突起，隨機選取外觀完整且折光性強的神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞記錄。在電流鉗下給躍階電流刺激，記錄的神經(jīng)元能誘發(fā)動作電位。只有能記錄到誘發(fā)的動作電位的神經(jīng)元才被用于電流鉗“Gap-free”連續(xù)記錄方式下觀察自發(fā)動作電位發(fā)放頻率。鉗制電壓-50 mV，記錄正常組大鼠弓狀核32個神經(jīng)元自發(fā)放電，平均放電頻率為(1.05±0.27)Hz。DM組大鼠弓狀核記錄26個神經(jīng)元自發(fā)放電，平均放電頻率為(0.19±0.04)Hz，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；記錄DM+EA組大鼠弓狀核33個神經(jīng)元自發(fā)放電，平均放電頻率為(0.55±0.14)Hz，與DM組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；記錄DM+假EA大鼠弓狀核27個神經(jīng)元自發(fā)放電，平均放電頻率為(0.21±0.07)Hz，與DM組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1，表2。

表2 電針對DM大鼠ARC神經(jīng)元自發(fā)動作電位發(fā)放頻率的影響

組別 正常組DM組DM+EA組DM+假EA組例數(shù) 32 263327發(fā)放頻率(Hz)1.05±0.270.19±0.04?0.55±0.14?△0.21±0.07?

*P<0.01，與正常組比較；△P<0.01，與DM組比較。

3 討論

STZ是一種廣譜抗菌素，具有抗菌、抗腫瘤和致DM的副作用，對實驗動物胰島B細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用。成年大鼠一次性大劑量(≥50 mg/kg)注射STZ直接造成胰島B細(xì)胞損傷，通常認(rèn)為該建模方式可誘導(dǎo)出T1DM[6]，故本實驗采用一次性大劑量注射STZ建立T1DM大鼠模型。在給予STZ注射后，DM組、DM+EA組和DM+假EA組大鼠，其空腹血糖水平均大于16.7 mmol/L，說明T1DM大鼠建模成功。

下丘腦是較高級的內(nèi)臟活動調(diào)節(jié)中樞，能將機體神經(jīng)、內(nèi)分泌和代謝信息進(jìn)行整合，并作出相應(yīng)的行為、自主神經(jīng)和內(nèi)分泌反射以維持機體能量平衡。下丘腦中ARC、室旁核(PVN)和穹隆周區(qū)(PFA)通過相互作用形成一種多核團(tuán)、多神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，共同完成對攝食行為的調(diào)節(jié)。ARC神經(jīng)元能合成和釋放多種調(diào)節(jié)攝食和代謝率的神經(jīng)肽，例如：α-促黑色素細(xì)胞激素、可卡因-安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽、NPY和刺鼠色蛋白相關(guān)蛋白(AgRP)等。當(dāng)機體進(jìn)食和能量代謝平衡波動時可引起相應(yīng)ARC釋放的神經(jīng)肽水平波動；同時，ARC位于血腦屏障的薄弱區(qū)，可直接感受血中葡萄糖、胰島素以及瘦素水平的變化，引起ARC神經(jīng)元活動的變化，進(jìn)而對機體攝食行為和能量代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。糖尿病時，糖代謝的急性和慢性紊亂及血管病變可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以致大腦神經(jīng)元的變性壞死，影響其功能，包括神經(jīng)電傳導(dǎo)和神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，出現(xiàn)自主神經(jīng)功能紊亂和精神癥狀[7]。

針刺穴位可以通過調(diào)整陰陽，疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血而達(dá)到治療疾病的目的，因此世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為針刺療法可以作為多種疾病的一種治療或輔助療法[8]。大量研究已經(jīng)證實針刺有其生理學(xué)、解剖學(xué)和神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)，如何用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科研手段來闡明針刺治療的作用機理是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)的重要課題之一。電針是一種通過在外周穴位進(jìn)行電流刺激而治療疾病的方法，是一種改進(jìn)后的現(xiàn)代針刺方法。外周穴位電針刺激可以引起相應(yīng)腦區(qū)和腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量的變化，進(jìn)而對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)[9-10]。劉志誠采用傳統(tǒng)針刺方法對2型糖尿病大鼠行外周穴位刺激后運用細(xì)胞外記錄方法觀察弓狀核自發(fā)放電變化[11-12]，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠弓狀核自發(fā)放電減少，通過外周針刺刺激后，自發(fā)放電增加，因此外周針刺可能對中樞核團(tuán)放電具有調(diào)節(jié)作用。本實驗我們采用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式，檢測腦片單個ARC神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率變化，發(fā)現(xiàn)T1DM大鼠ARC單個神經(jīng)元自發(fā)動作電位發(fā)放頻率減少，功能減弱，通過多次外周穴位電針刺激后，ARC單個神經(jīng)元自發(fā)動作電位發(fā)放頻率增加，功能恢復(fù)，糖尿病“三多一少”的癥狀緩解；同時在給予外周穴位不通電流的假電針刺激后，其ARC神經(jīng)元自發(fā)動作電位發(fā)放頻率與單純DM大鼠沒有差異，根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們認(rèn)為，外周穴位電針可以維持和促進(jìn)糖尿病大鼠ARC神經(jīng)元活性，維持其在能量代謝中的正常調(diào)節(jié)功能。

本研究已經(jīng)觀察到外周穴位電針可以通過調(diào)節(jié)下丘腦ARC神經(jīng)元功能參與能量代謝的調(diào)節(jié)，改善T1DM大鼠“三多一少”的癥狀但受電針調(diào)節(jié)的ARC神經(jīng)元究竟是何種神經(jīng)元以及引起ARC中何種神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變還需進(jìn)一步研究明確。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Rosas-Arellano MP，Solano-Flores LP，Ciriello J．Effect of arcuate nucleus activation on neuronal activity in subfornical organ[J].Brain Res，1993，619(1-2)：352-356.

[2] 張秋娟，鄭敏，許旭偉，等．針灸對糖尿病及其慢性并發(fā)癥的干預(yù)效應(yīng)[J].中國臨床康復(fù)，2005，9(47)：99-101.

[3] 郭義.實驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2008：403.

[4] Glaum SR，Hara M，Bindokas VP，et al．Leptin，the obese gene product，rapidly modulates synaptic transmission in the hypothalamus[J].Mol Pharmacol，1996，50(2)：230-235.

[5] Paxinos G，Watson C．The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates[M].Amsterdam：Academic Press，2007：47-48.

[6] 李聰然，游雪甫，蔣建東．糖尿病動物模型及研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，15(1)：59-63.

[7] Biessels GJ，Kappelle AC，Bravenboer B，et al．Cerebral function in diabetes mellitus[J].Diabetologia，1994，37(7)：643-650.

[8] NIH Consensus Conference．Acupuncture[J].JAMA，1998，280(17)：1518-1524.

[9] 徐倩，田苗，陳淑諭，等．電針對鋁癡呆兔行為及腦脊液-海馬區(qū)谷氨酸含量的影響[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(1)：68-69.

[10] 郝俊偉，馬淑蘭，姜建偉，等．核團(tuán)微量注射下丘腦視前區(qū)"針刺灌流液"對去卵巢大鼠整體效應(yīng)的研究[J].上海針灸雜志，2006，25(9)：46-50.

[11] 劉志誠，孫鳳岷，袁愛紅，等．針刺對2型糖尿病大鼠弓狀核的調(diào)整作用[J].中國實用醫(yī)藥，2006，1(6)：1-3.

[12] 徐放明，劉志誠．針刺對Ⅱ型糖尿病大鼠弓狀核神經(jīng)細(xì)胞自發(fā)放電的影響[J].針刺研究，2003，28(1)：26-29.