王發(fā)選，許紅霞，張洋，楊婷，黃程君，任曉慧，蘭亞佳，張勤

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生教研室，寧夏 銀川 750004；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生教研室，四川 成都 610041；3.上海市浦東區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200136)

迄今為止，矽肺的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，多年的研究發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞與SiO2相互作用而產(chǎn)生的諸多因子在矽肺發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性作用[1]。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)是生物體抵御外來微生物入侵的天然屏障，是機(jī)體固有性免疫系統(tǒng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞。AM位于肺泡腔及微小氣道內(nèi)，是肺組織內(nèi)重要的常駐細(xì)胞和防御細(xì)胞。除發(fā)揮吞噬防御功能外，還可通過分泌大量的細(xì)胞因子啟動和調(diào)節(jié)局部的免疫炎癥性反應(yīng)。在矽肺發(fā)病機(jī)制的各種學(xué)說中，巨噬細(xì)胞受損是其中重要機(jī)制[2]。本研究采用大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞為研究對象，通過不同劑量粉塵刺激細(xì)胞，分析炎癥因子的表達(dá)情況，為后續(xù)矽肺發(fā)病機(jī)制的體外研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

NR8383大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 主要試劑及儀器

標(biāo)準(zhǔn)石英粉塵(SiO2純度99%，粒子大小范圍在0.5～10 μm，80%的粒子直徑在1～5 μm之間，Sigma 公司，美國)、MTT(Sigma 公司，美國)、RNA store液、瓊脂糖、DNA Ladder、6×Loading Buffer、Green view(天根生化，中國)、TRIZOL試劑(Life science，美國)、異丙醇、氯仿(成都科華試劑，中國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Realtime qPCR試劑盒、RNase-free水(Takara公司，日本)、qPCR 引物(上海生工生物工程公司)。

SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化，中國)，-80 ℃冰箱、純水儀(Millipore 公司，美國)，高速低溫離心機(jī)(Thermo Fisher公司，美國)，凝膠成像分析系統(tǒng)、普通PCR儀、實時熒光定量PCR儀CFX96(Bio-rad公司，美國)，紫外分光光度儀(島津公司，日本)，電泳儀、電泳槽(北京六一，中國)。

1.3 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)

復(fù)蘇NR8383細(xì)胞，用含有15%FBS的Ham’S F12K細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，接種密度以1×105/mL為宜，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每三天更換一次培養(yǎng)液。一般4～6 d長滿，按照1：3傳代。NR8383細(xì)胞為半貼壁細(xì)胞，一部分細(xì)胞懸浮生長，一部分貼壁生長。傳代時將懸浮細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)入離心管中，貼壁細(xì)胞加入少量胰蛋白酶消化約1 min，含血清培養(yǎng)基終止消化后，輕輕吹打，一起將細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1 000 rpm離心5 min，棄上清，加新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重懸細(xì)胞，然后接種到新瓶或培養(yǎng)板中。實驗選用細(xì)胞為對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍(lán)拒染率>95%的細(xì)胞。

1.4 NR8383細(xì)胞在粉塵刺激下細(xì)胞活力的改變

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用15%FBS的F12K完全培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔3×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL溶液。將接種后的96孔板放入5%CO2、37 ℃細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。然后加入終濃度為5 μg/cm2、10 μg/cm2、20 μg/cm2、40 μg/cm2、80 μg/cm2的粉塵懸液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，于終止培養(yǎng)前每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃溫育4 h后吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 200 μL終止反應(yīng)，振蕩10 min，全自動酶標(biāo)檢測儀測定各孔的光密度OD值。實驗波長為490 nm，每組設(shè)8個復(fù)孔，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的為空白組，而只加培養(yǎng)液不予任何試劑干預(yù)的細(xì)胞為對照組，按下列公式計算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%

1.5 NR8383細(xì)胞在粉塵刺激下形態(tài)學(xué)改變

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用15%FBS的F12K完全培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔103～104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL溶液。將接種后的96孔板放入5%CO2、37 ℃細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察粉塵刺激后各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用15%FBS的F12K完全培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔6×105個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL溶液。將接種后的96孔板放入5%CO2、37 ℃細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。然后加入終濃度為100 μg/cm2、20 μg/cm2、40 μg/cm2的粉塵混懸液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 rpm離心5 min。TRIZOL法提取離心后細(xì)胞的總RNA，利用紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的完整性。采用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min，合成cDNA。根據(jù)大鼠TNF-α，IL-1β，TGF-β和β-actin mRNA全長序列采用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。按照說明書配制RT-qPCR反應(yīng)體系，采用兩步法RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，后制作溶解曲線確定產(chǎn)物的特異性，然后用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定PCR產(chǎn)物。基因相對表達(dá)量用RQ值表示，RQ=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct目的基因-△Ct對照，△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△Ct對照=Ct對照組目的基因-Ct內(nèi)參基因。

表1 TNF-α，IL-1β，TGF-β基因引物

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組細(xì)胞存活率比較采用方差分析，組間比較采用SNK法。對TNF-α，IL-1β，TGF-β基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計描述，利用成組設(shè)計的秩和檢驗分析各組差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞為半貼壁細(xì)胞，部分貼壁，部分不貼壁，不貼壁的細(xì)胞成簇狀，晃動培養(yǎng)基后，發(fā)現(xiàn)簇狀細(xì)胞會游動。細(xì)胞呈圓形，遮光性好(圖1A)。

染塵細(xì)胞：同樣為半貼壁細(xì)胞，高倍鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)吞噬有許多細(xì)胞顆粒(箭頭所示)，遮光性強(qiáng)。在培養(yǎng)瓶底還看見許多未被細(xì)胞吞噬的粉塵顆粒(圖1B)。

2.2 NR8383細(xì)胞在粉塵刺激下細(xì)胞活力的改變

不同劑量粉塵刺激NR8383細(xì)胞后，隨著染塵劑量的增加，細(xì)胞存活率均有不同程度的降低，以80 μg/cm2組降低最為明顯，其他各組與80 μg/cm2組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其余各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

表2 MTT法測定SiO2粉塵對NR8383細(xì)胞存活率的影響(n=8)

*P<0.01，與80 μg/cm2組比較。

2.3 總RNA的質(zhì)量

利用紫外分光光度計測定，各樣品的OD260/OD280>1.9。表明提取RNA的純度、濃度質(zhì)量合格，可以用于后續(xù)實驗。各樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜5 s、18 s和28 s條帶較清晰(圖2A)，可以用于后續(xù)實驗。

2.4 Realtime-qPCR結(jié)果

各染塵組細(xì)胞TNF-α，IL-1β，TGF-β的mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著染塵劑量的遞增，TNF-α，IL-1β，TGF-β的mRNA相對表達(dá)水平逐漸增高。

表3 各染塵組與對照組TNF-α，IL-1β，TGF-β的mRNA相對表達(dá)水平

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較；#P<0.05， ##P<0.01，與10 μg/cm2組比較；△P<0.05，與20 μg/cm2組比較。

2.5 Realtime-qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

TNF-α，IL-1β和TGF-β的擴(kuò)增產(chǎn)物均為一條清晰條帶，與DNA Ladder相比，基因TNF-α擴(kuò)增產(chǎn)物的長度介于100～150 bp之間?；騃L-1β擴(kuò)增產(chǎn)物的長度介于200～250 bp之間，基因TGF-β擴(kuò)增產(chǎn)物的長度介于50～100 bp之間，接近100 bp，基因IFN-γ的產(chǎn)物長度介于50～100 bp之間，兩者均與設(shè)計引物的產(chǎn)物長度相一致(圖2B)。

3 討論

既往用于矽肺機(jī)制研究體外研究的肺泡巨噬細(xì)胞主要是通過大鼠支氣管肺泡灌洗獲得。其制備和純化方法繁瑣，收獲細(xì)胞量少且容易污染，體外培養(yǎng)存活時間短，且傳代多次后，細(xì)胞增殖能力明顯降低，應(yīng)用比較局限。所以后來的研究中多采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系，人單核細(xì)胞株(THP-1細(xì)胞)和大RAW264.7鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(NR8383細(xì)胞)來代替原代肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，而在這三種細(xì)胞系中，真正來源于肺組織的細(xì)胞系只有NR8383細(xì)胞一種。其中人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞用于體外研究時，只有經(jīng)佛波酯(PMA)刺激后，可分化為巨噬細(xì)胞[3]，分化后的細(xì)胞才具有與人肺泡巨噬細(xì)胞相似特性[4-5]，所以應(yīng)用也比較局限。

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞是正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)數(shù)代后形成的細(xì)胞系，具有正常AM的生物學(xué)特征[6]。NR8383細(xì)胞系能夠提供研究肺泡巨噬細(xì)胞適合的試驗系統(tǒng)，能夠?qū)ν庠诖碳ぎa(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，可用于體外肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)功能和肺部炎癥的研究[7-8]。在本研究中，我們選擇不同劑量游離二氧化硅粉塵刺激NR8383細(xì)胞，采用熒光定量PCR法檢測不同劑量粉塵刺激后細(xì)胞分泌炎癥因子的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR8383細(xì)胞在接受粉塵刺激后，分泌的炎癥因子量明顯增加，提示NR8383細(xì)胞可以作為后續(xù)矽肺發(fā)病機(jī)制研究，尤其是免疫機(jī)制研究中應(yīng)該優(yōu)先選擇的實驗材料。體外研究很好的研究對象。

在矽肺發(fā)病機(jī)制的各種學(xué)說中，炎癥反應(yīng)學(xué)說一直占據(jù)著主導(dǎo)地位，炎癥因子的變化是粉塵致機(jī)體損害的早期反應(yīng)。粉塵進(jìn)入呼吸道以后，由于其機(jī)械刺激作用，巨噬細(xì)胞作為最早反應(yīng)的靶細(xì)胞，吞噬石英粉塵顆粒后被活化，釋放各種前炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)，介導(dǎo)炎性和纖維化過程[9-10]。同時這些因子可誘導(dǎo)其他單核細(xì)胞向炎性部位聚集，擴(kuò)大炎性反應(yīng)的范圍和程度[11]。長期以來我們只關(guān)注這些因子對下游其他細(xì)胞的影響，實際上像IL-1β這些炎癥因子有明顯的自身反饋調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)的放大效應(yīng)，在各種急慢性非感染性炎性疾病和肺纖維化過程中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。這可能是粉塵刺激巨噬細(xì)胞后分泌炎癥因子增多的主要機(jī)理。

本研究采用大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(NR8383細(xì)胞)作為研究對象，分析粉塵刺激12 h后各種炎癥因子的變化，明確這些炎癥因子的作用可為矽肺發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的思路，進(jìn)而通過調(diào)控這些炎癥因子，來干預(yù)介導(dǎo)矽肺發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，可能給矽肺的纖維化干預(yù)甚至治療帶來新希望。由于本研究只設(shè)置了三個劑量，而且只做了染塵12 h后各種炎癥因子的變化，未能動態(tài)反映粉塵作用于細(xì)胞后，不同時間點(diǎn)各種細(xì)胞因子的動態(tài)變化。這些因子的產(chǎn)生機(jī)理以及在矽肺發(fā)病和纖維化進(jìn)程中發(fā)揮何種作用有待深入的功能學(xué)研究。

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