姜學(xué)東，王 瓊，劉長(zhǎng)浩，王國(guó)柱

miR21抑制劑對(duì)肺腺癌細(xì)胞A-549的抑制效果

姜學(xué)東，王 瓊，劉長(zhǎng)浩，王國(guó)柱

目的探討miR21抑制劑轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A-549對(duì)其體外侵襲及血管形成能力的影響。方法miR21抑制劑轉(zhuǎn)染A-549細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的A-549細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h后，四甲基偶唑氮法(MTT)法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖抑制率；Transwell方法檢測(cè)miR21抑制劑對(duì)A-549細(xì)胞侵襲的影響；小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR21抑制劑對(duì)血管形成的影響。結(jié)果轉(zhuǎn)染24 h，兩組抑制率比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染48 h及以后，抑制劑組抑制率均高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示miR21抑制劑組每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)(11.60±5.32)個(gè)遠(yuǎn)少于對(duì)照組(107.60±3.21)個(gè)，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。抑制劑組每視野小管計(jì)數(shù)平均(159.30±0.51)個(gè)，遠(yuǎn)少于對(duì)照組(508.80±1.30)個(gè)，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論miR21抑制劑能夠明顯抑制A-549的侵襲能力，并能明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，提示miR21抑制劑可以作為潛在的肺癌基因治療的新方法。

miR21抑制劑；細(xì)胞侵襲；血管形成；肺腺癌

Micro RNA (miRNA) 是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，是人類基因組的主要調(diào)控因子。目前這些微小的細(xì)胞成分已進(jìn)入到首選藥物的行列中[1,2]。特別是在癌癥中，某些miRNA本身就是非常有“誠(chéng)意”的癌基因和腫瘤抑制基因，完全符合成為理想干預(yù)治療點(diǎn)的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。“癌基因依賴”一詞，過(guò)去專指蛋白質(zhì)編碼的癌基因，本意是指癌癥細(xì)胞生存特異性地依賴某個(gè)激酶，因此對(duì)其抑制劑異常敏感，最近這個(gè)術(shù)語(yǔ)已延伸用于miRNA[3]。miRNA的治療功能是基于其天然的催化過(guò)程，1個(gè)既定的miRNA可以控制多種癌基因，并對(duì)癌癥中的致癌通路進(jìn)行管制。正是由于miRNA具有這種能力，同時(shí)鑒于癌癥是一種不能通過(guò)針對(duì)單個(gè)基因而被成功治療的異質(zhì)性疾病[4]，因此未來(lái)對(duì)miRNA的控制能力可能是治療成功與否的關(guān)鍵。miR21是人類細(xì)胞或組織中存在較為廣泛并且發(fā)現(xiàn)較早的miRNA，在人類miRNA的功能研究中發(fā)揮了不可替代的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR21在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)了抗凋亡因子的角色[5]。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR21抑制劑至肺腺癌細(xì)胞A549，觀察其對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲及血管形成的影響，為肺腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供人肺腺癌細(xì)胞A-549、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，美國(guó)GIBCO 提供RPMI1640培養(yǎng)液，上海吉瑪提供miR21抑制劑，美國(guó)Corning提供Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Transwell小室、96孔板，美國(guó)BD提供Matrigel膠。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 無(wú)菌培養(yǎng)瓶中接種人肺腺癌細(xì)胞A-549和HUVEC細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的適量PRMI-1640培養(yǎng)液，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化人肺腺癌細(xì)胞A549和HUVEC細(xì)胞，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后用miR21 抑制劑終濃度100 nM轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(抑制劑組)，同時(shí)設(shè)定未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3 MTT檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期A549細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)液，無(wú)CO2條件下培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板，各組設(shè)4個(gè)平行孔，每孔反應(yīng)體系總體積為200 μl。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞1、2、3、7、14 d時(shí)，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液后加入150 μl二甲基亞砜(DSMO)，在微量振蕩器振蕩10 min，室溫孵育30 min，檢測(cè)光密度值(OD)。凋零組OD值為不加細(xì)胞的空白凋零A490的OD值均數(shù)，各濃度組的OD值為平行孔的平均OD值。對(duì)照組OD值為空白對(duì)照組的平均OD值， miR21抑制劑抑制人肺腺癌細(xì)胞A549增殖的作用采用細(xì)胞增殖抑制率CI表示，計(jì)算公式如下：CI(% ) = (對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)OD/(對(duì)照組-凋零組)OD×100%。相同條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 侵襲實(shí)驗(yàn)和小管形成試驗(yàn) 用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel，稀釋比例為1∶4。在Transwell上室中加入0.04 ml的Matrigel稀釋液，孵育1 h，使膠凝固，保持37 ℃。每組人肺腺癌細(xì)胞A-549用無(wú)血清培養(yǎng)液(含0.1% BSA)重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105/ml。上室加入0.01 ml細(xì)胞，下室加入0.5 ml含血清培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)2 d后，取出小室，用棉簽擦掉上膜細(xì)胞，小室以甲醇固定和結(jié)晶紫染色各15 min，然后鏡檢，每個(gè)濾膜取5個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)取平均值并分析。測(cè)取96孔板-20 ℃預(yù)冷后，每孔用500 μl的Matrigel原液包被，搖動(dòng)使之均勻分布于孔的各個(gè)部位并避免產(chǎn)生氣泡。保持溫度37 ℃，孵育1 h，使膠凝固。調(diào)整HUVEC細(xì)胞濃度至2.0×105/ml，每孔接種0.1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后用顯微鏡觀察，取5個(gè)視野(×100)，取均值計(jì)數(shù)，照相分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h，兩組抑制率比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染48 h及以后，抑制劑組抑制率均高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 抑制劑組每個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)平均(11.60±5.32)個(gè)，對(duì)照組(107.60±3.21)個(gè)；與對(duì)照組相比，抑制劑組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 小管形成試驗(yàn) 抑制劑組每視野小管計(jì)數(shù)平均(159.30±0.51)個(gè)，對(duì)照組(508.80±1.30)個(gè)，抑制劑組與對(duì)照組比較，能明顯抑制血管形成(P<0.01，圖2)。

3 討 論

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，其中肺腺癌約占50%，對(duì)人們健康危害極大[6]。藥物基因組學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使得肺癌的個(gè)體化治療在臨床實(shí)踐中得到運(yùn)用，基因治療作為一種特異高效的強(qiáng)治療方法，越來(lái)越受到人們重視。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，以及人們對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制的了解日益深化，說(shuō)明了很多基因可作為肺癌基因治療的有效靶基因。

近年來(lái)，miRNA在多種生物體中的存在不斷得到證實(shí)。研究者用生物信息學(xué)、基因表達(dá)和克隆等方法發(fā)現(xiàn)了大量未知miRNAs，并將這些miRNAs歸類編號(hào)[7]。miR21位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域上，是具有自主轉(zhuǎn)錄單位的一種miRNA[8]。研究表明，miRNA有致癌作用，在多種腫瘤細(xì)胞中miR21的表達(dá)均顯著異常，參與調(diào)控多種抑癌基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR21的表達(dá)升高，抑制miR21 能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，致使凋亡相關(guān)蛋白酶活性升高，使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存能力顯著降低[9]。研究表明，miR21作為介入治療的靶標(biāo)，抑制miR21可上調(diào)TMP1、PDCD4和maspin的表達(dá)，減少乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵入肺部[10]。抑制miR21可以作為晚期癌癥防治的一種新的治療措施。

本研究中，MTT實(shí)驗(yàn)顯示，導(dǎo)入miR21抑制劑能夠明顯抑制肺腺癌細(xì)胞A549；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，導(dǎo)入miR21抑制劑的肺腺癌細(xì)胞A549較未導(dǎo)入的A549細(xì)胞，增殖明顯被抑制；同樣，導(dǎo)入miR21抑制劑的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于未導(dǎo)入miR21抑制劑的A549細(xì)胞。小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，導(dǎo)入miR21抑制劑的HUEC細(xì)胞形成血管的細(xì)胞數(shù)明顯少于未導(dǎo)入miR21抑制劑的HUVEC細(xì)胞。

綜上所述， miR21抑制劑轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞A549后增殖可明顯被抑制，同時(shí)miR21抑制劑轉(zhuǎn)染的HUVEC細(xì)胞能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力，以及細(xì)胞的侵襲活性。由此表明，miR21可能通過(guò)抑制腫瘤組織內(nèi)血管的生成能力及肺癌細(xì)胞的侵襲能力，從而抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，這將為肺腺癌基因治療研究提供新的試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

[1] Vimalraj S, Miranda P J, Ramyakrishna B,etal. Regulation of breast cancer and bone metastasis by MicroRNAs[J]. Dis Markers, 2013, 35(5): 369-387.

[2] Li J, Xu J, Cheng Y,etal. Circulating micro RNAs as mirrors of acute coronary syndromes: MiRacle or quagMire? [J]. J Cell Mol Med, 2013, 4(11): 564-568.

[3] Song G, Xu G, Ji C,etal. The role of micro RNA-26b in human adipocyte differentiation and proliferation [J]. Gene,2014,533(2): 481-487.

[4] Abu-Halima M, Backes C, Leidinger P,etal. MicroRNA expression profiles in human testicular tissues of infertile men with different histopathologic patterns [J]. Fertil Steril，2014, 101(1): 78-86.

[5] Cortinovis D, Monica V, Pietrantonio F,etal. MicroRNAs in non-small cell lung cancer: current status and future therapeutic promises[J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(35):5961-5966.

[6] 周彩存, 任勝祥. 肺癌非手術(shù)治療進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2007, 27(1)：5-7.

[7] Kang H Y. MicroRNA-21 regulates stemness in cancer cells[J]. Stem Cell Res Ther，2013，4(5): 110-113.

[8] Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma [J]. Nature，2013, 499(7456): 43-49.

[9] Risbud R M, Lee C, Porter B E. Neurotrophin-3 mRNA a putative target of miR21 following status epilepticus[J]. Brain Res, 2011, 18(1424): 53-59.

[10] Sheth S, Jajoo S, Kaur T,etal. Resveratrol reduces prostate cancer growth and metastasis by inhibiting the Akt/MicroRNA-21 pathway[J].PLoS One, 2012,7(12):51655-51660.

(2014-01-21收稿 2014-02-07修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

InhibitionofmiR21inhibitoronA-549cellsinvitro

JIANG Xuedong, WANG Qiong, LIU Changhao, and WANG Guozhu. Department of Thoracic Cardiovascular Surgery, Liaoning Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Shenyang 110034, China

ObjectiveTo study the inhibition of miR21 inhibitor on the invasion and anti-angiogenesis of A-549 cells.MethodsMiR21 inhibitor was transfected into A-549, and the control group was set up. 24, 48, 72, 96 hours after transfection, the effect of growth suppressing was quantified by 3-2(4，5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay, anti-invasion was observed by transwell assay. Tube formation assay was used to detect the effects of miR21 inhibitor on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) angiogenesis.ResultsTwenty-four hours after transfection, the suppressing rate was different between the two groups; 48, 72, 96 h after transfection, the suppressing rates in inhibition group were higher than those in control group, the difference was statistically significant(P<0.05). By transwell assay, number of cells in inhibition group (11.60±5.32) was less than that in control group (107.60±3.21), the difference was statistically significant(P<0.01). Tubes in inhibition group (159.30±0.51) was less than that in control group (508.80±1.30), the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionsmiR21 inhibitor can inhibit the invasion of A-549 and angiogenesis of HUVEC. miR21 inhibitor can be a potential gene-therapy for gastric carcinoma.

miRNA21 inhibitor; invasion; angiogenesis; lung adenocarcinoma

姜學(xué)東，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail: jiangxd08@sina.com

110034沈陽(yáng)，武警遼寧總隊(duì)醫(yī)院胸外科

R734.2