葛 暢 許春偉 王魯平 方 園 張玉萍

北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科，北京100700

5'-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)HT-29和LoVo結(jié)直腸癌細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)、m RNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響

葛 暢 許春偉 王魯平 方 園 張玉萍

北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科，北京100700

目的探討甲基化酶抑制劑5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-2'-deoxycytidine，5'-Aza-CdR）對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化水平及蛋白表達(dá)的影響。方法用不同濃度（0.5、1.0、1.5μmol/L）5'-Aza-CdR處理結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo。應(yīng)用TaqMan探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR（Methylight）方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）檢測(cè)藥物處理前后HT-29和LoVo細(xì)胞中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)、mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果Methylight檢測(cè)HT-29和LoVo細(xì)胞中Wif-1蛋白在藥物作用后異常甲基化得到逆轉(zhuǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)到0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR處理后Wif-1基因mRNA和蛋白重新表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DMSO對(duì)照組和不同濃度5'-Aza-CdR（0.5、1.0、1.5μmol/L）在HT-29細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量分別為（1.000±0.000）、（1.207±0.052）、（1.790±0.033）和（2.016±0.123）；在LoVo細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量分別為（1.000±0.000）、（1.294±0.048）、（1.893±0.061）和（2.204±0.041）。Western blot檢測(cè)Wif-1蛋白檢測(cè)DMSO對(duì)照組和不同濃度5'-Aza-CdR在HT-29細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量分別為（0.456±0.040）、（0.511±0.025）、（0.857±0.031）和（0.934±0.047）；LoVo細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量分別為（0.842±0.032）、（0.844±0.044）、（0.854±0.037）和（0.856±0.034）。以上作用均呈時(shí)間、劑量依賴性，Wif-1基因mRNA在HT-29細(xì)胞株表達(dá)和LoVo細(xì)胞株表達(dá)差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=144.823，P=0.000；F=476.195，P=0.000）。Wif-1蛋白表達(dá)在HT-29細(xì)胞株表達(dá)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 129.674，P=0.000），但Wif-1蛋白表達(dá)在LoVo細(xì)胞株表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.117，P=0.948）。結(jié)論結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1啟動(dòng)子甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能夠較成功地逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)，并能恢復(fù)mRNA及蛋白重新表達(dá)。

DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅位于肺癌和前列腺癌（女性為乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率約占全部惡性腫瘤死亡總?cè)藬?shù)的8%，在惡性腫瘤死因中居第4位[1]。CRC的發(fā)生與發(fā)展與癌基因和抑癌基因的缺失、擴(kuò)增或突變有關(guān)。有些基因在染色質(zhì)水平上發(fā)生表型遺傳修飾改變也會(huì)導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)。表型遺傳修飾最多見(jiàn)的是CpG島（CpG island）的甲基化改變。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人類染色體12q14.3上，由10個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)約200 kb。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的重要途徑之一，其異常激活已發(fā)現(xiàn)與多種人類腫瘤密切相關(guān)[2]。Wif-1基因是這條通路的下游區(qū)基因也是這條通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多種腫瘤中都已證實(shí)是存在的，它作為一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其啟動(dòng)子的高甲基化參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-CdR）對(duì)HT-29和LoVo細(xì)胞株作用后Wif-1基因的DNA層面、mRNA層面和蛋白層面的改變，探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Wif-1基因失活的甲基化機(jī)制及藥物恢復(fù)Wif-1基因表達(dá)的可能性，以期尋找CRC的腫瘤標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部107實(shí)驗(yàn)室）；DNA提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）；核酸蛋白質(zhì)濃度測(cè)量?jī)xB-500（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司），DNA甲基化修飾試劑盒及甲基化陽(yáng)性/陰性對(duì)照（美國(guó)ZYMO公司）；qPCR反應(yīng)試劑ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海輝睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美國(guó)Sigma公司），以DMSO溶劑充分溶解后配制成0.1μmol/L的母液，分裝后-80℃保存；Wif-1和內(nèi)參βactin（美國(guó)Santa Cruz公司），Western blot相關(guān)試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)

結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100μ/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化傳代。取貼壁生長(zhǎng)良好的細(xì)胞以RPMI1640調(diào)整細(xì)胞密度至2×106/mL，接種于六孔培養(yǎng)板。干預(yù)的LoVo和HT-29細(xì)胞分別加入0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR混合培養(yǎng)液，每24小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)作用72 h；以HT-29和LoVo分別加入等量DMSO溶劑培養(yǎng)作為對(duì)照（0μmol/L）。

1.3Methylight方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29和LoVo細(xì)胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）說(shuō)明提取上述兩種細(xì)胞不同濃度梯度的細(xì)胞DNA，用紫外分光光度儀（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司）測(cè)DNA濃度，以DNA濃度在25 ng/μL為最低濃度，使用DNA修飾試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，Wif-1基因甲基化引物和探針設(shè)計(jì)：Wif-1基因序列參照GenBank。甲基化引物和探針由Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計(jì)，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'-TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探針：FAM 5'-CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3'BHQ1，內(nèi)參β-actin基因甲基化按文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探針：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反應(yīng)總體系為20μL，2×Taq PCR Master Mix 10μL；修飾后的DNA模板2μL；上、下游引物各1μL（10 pmol）；探針FAM 0.4μL（10 pmol）；ROX 0.3μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，52℃45 s，72℃45 s，共50個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃冷卻5min。經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated&Non-methylatedDNA Set作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表達(dá)情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29和LoVo細(xì)胞，胰酶消化后抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，上游引物：5'-GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20Μl PCR反應(yīng)體系含10μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10μmol/L）各1、0.3μLROX Reference Dye（50×）、4.0μL DNA模板、3.7μL dH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，55℃40 s，72℃45 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。擴(kuò)增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1mRNA表達(dá)。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因）-（Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參基因）。1.5 Western blot分析結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中W if-1蛋白的表達(dá)情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29和LoVo細(xì)胞，在上述兩種細(xì)胞株各個(gè)濃度梯度的每管細(xì)胞中加入80μL蛋白裂解和1μL蛋白酶抑制劑PMSF液于冰上裂解30min。15 000 r/min 37℃離心，10min后取上清液提取總蛋白，BCA法蛋白定量?？偟鞍?00℃變性5 min后，配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，蛋白電泳分離后經(jīng)電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜。BSA室溫封閉2 h后，PVDF膜置于1∶200稀釋的Wif-1單克隆抗體稀釋液中4℃冰箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋液中37℃培養(yǎng)2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL發(fā)光液顯影，采集并分析處理圖像。凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析各條帶吸光度值，以0.5μmol/L 5'-Aza-CdR條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）為基準(zhǔn)，設(shè)置為1。以目的基因條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）作為Wif-1蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.6 MethyLight結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

同時(shí)擴(kuò)增目的基因（W if-1）和內(nèi)參基因（βactin），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到兩者的原始拷貝數(shù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)甲基化指數(shù)（the normalized index ofmethylation，NIM）。其定義為：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，Wif-1 positive指陽(yáng)性對(duì)照中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，β-actin sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，β-actin positve指陽(yáng)性對(duì)照中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)。NIM≥4為甲基化，NIM＜4為非甲基化[4]。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），行配對(duì)t檢驗(yàn)，并設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化狀況

將陽(yáng)性對(duì)照按10的倍數(shù)稀釋成1×100～1×10-67個(gè)濃度梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（其拷貝數(shù)為103～109/mL）。各濃度梯度反應(yīng)均做復(fù)孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.907。實(shí)時(shí)熒光定量PCR得出數(shù)據(jù)按MethyLight結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，在DMSO對(duì)照組、0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和Lo-Vo細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。見(jiàn)表1、圖1。

表1 HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀況

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表達(dá)狀況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR得出的數(shù)據(jù)檢驗(yàn)擴(kuò)增效率（E）通過(guò)公式E=2-1/斜率-1計(jì)算，Wif-1基因mRNA為0.945，GAPDH基因mRNA為0.977，兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率相差＜5%，符合用2-ΔΔCt法相對(duì)定量分析條件。經(jīng)2-ΔΔCt法分析并以對(duì)照組、各不同濃度實(shí)驗(yàn)分組為橫坐標(biāo)，將測(cè)出相應(yīng)的平均相對(duì)定量比值為縱坐標(biāo)，繪出柱狀圖后發(fā)現(xiàn)0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1基因的mRNA表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組上調(diào)，并且有時(shí)間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對(duì)照組比較，0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P= 0.005）；LoVo細(xì)胞株中Wif-1 mRNA表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組上調(diào)，并且有時(shí)間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與對(duì)照組比較，0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.656，P =0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。見(jiàn)表2、圖2。

圖1 各組HT-29及LoVo細(xì)胞株Wif-1基因DNA甲基化擴(kuò)增曲線

圖2 各組HT-29及LoVo細(xì)胞株Wif-1基因mRNA表達(dá)

表2 HT-29和LoVo細(xì)胞株中W if-1基因mRNA表達(dá)狀況（±s）

表2 HT-29和LoVo細(xì)胞株中W if-1基因mRNA表達(dá)狀況（±s）

注：與DMSO對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別細(xì)胞株HT-29 LoVo DMSO對(duì)照組0.5μmol/L 5'-Aza-CdR組1.0μmol/L 5'-Aza-CdR組1.5μmol/L 5'-Aza-CdR組F值P值1.000±0.000 1.207±0.052*1.790±0.033**2.016±0.123**144.823 0.000 1.000±0.000 1.294±0.048**1.893±0.061**2.204±0.041**476.195 0.000

2.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和LoVo中W if-1蛋白表達(dá)狀況

Western blot結(jié)果運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行條帶圖像分析，獲得HT-29和LoVo細(xì)胞株各條帶光密度值，并計(jì)算出兩種細(xì)胞在各組中的平均光密度比值，進(jìn)行半定量分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以各實(shí)驗(yàn)分組為橫坐標(biāo)，將測(cè)出相應(yīng)的平均光密度比值為縱坐標(biāo)，繪出柱狀圖后發(fā)現(xiàn)0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性（F=129.674，P= 0.000），與DMSO對(duì)照組比較，1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.825，P= 0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因的蛋白表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組略微上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.117，P= 0.948），與DMSO對(duì)照組比較，0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.414，P= 0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。見(jiàn)表3、圖3。

表3 HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)狀況（±s）

表3 HT-29和LoVo細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)狀況（±s）

注：與DMSO對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別細(xì)胞株HT-29 LoVo DMSO對(duì)照組0.5μmol/L 5'-Aza-CdR組1.0μmol/L 5'-Aza-CdR組1.5μmol/L 5'-Aza-CdR組F值P值0.456±0.040 0.511±0.025 0.857±0.031**0.934±0.047*129.674 0.000 0.842±0.032 0.844±0.044**0.854±0.037**0.856±0.034**0.117 0.948

圖3 各組HT-29細(xì)胞株及LoVo細(xì)胞株W if-1蛋白表達(dá)

3 討論

CRC是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，每年全球新發(fā)病例達(dá)123萬(wàn)，病死率約為發(fā)病率的1/2。我國(guó)CRC發(fā)病率雖低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，但近20年來(lái)CRC的發(fā)病率仍在逐漸上升，同時(shí)，其發(fā)病年齡有增高趨勢(shì)。近年研究表明CRC的發(fā)病是多因素、多階段、多基因連續(xù)累積發(fā)生的過(guò)程，除遺傳學(xué)改變外，表觀遺傳學(xué)改變亦參與CRC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。表觀遺傳學(xué)是指不涉及DNA序列改變，但基因表達(dá)卻發(fā)生可遺傳的改變，DNA甲基化、組蛋白修飾、MicroRNA等是表觀遺傳學(xué)的主要形式。與腫瘤發(fā)生關(guān)系最密切的是DNA甲基化修飾異常，其中包括基因組去甲基化及部分區(qū)域高度甲基化兩種形式。DNA甲基化可以導(dǎo)致癌相關(guān)基因沉默，病變迅速進(jìn)展為癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能認(rèn)識(shí)CRC中基因異常DNA甲基化，將可能獲得CRC診斷的腫瘤標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)[5-7]。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)迄今已數(shù)十年，作為一條高度保守的信號(hào)通路在動(dòng)物胚胎的器官發(fā)育各個(gè)階段均發(fā)揮異常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的拮抗基因之一，屬SFRP拮抗家族，在種族間高度保守，最早在人類視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)[8]。它主要通過(guò)捆綁Wnt信號(hào)蛋白，阻止其與Frizzled受體相互作用，從而抑制通路的異常激活。Nosho等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在早期CRC中伴有Wif-1表達(dá)的下調(diào)，可能通過(guò)引起經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致通路下游靶基因的過(guò)度表達(dá)，伴隨細(xì)胞過(guò)度的增殖和失控的分化從而引起腫瘤的發(fā)生。表觀遺傳學(xué)改變?nèi)缁?′端CpG島甲基化是Wif-1基因失活的重要機(jī)制。已有一系列研究證實(shí)在各系統(tǒng)腫瘤中，啟動(dòng)子區(qū)甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究顯示，Wif-1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率都很高，分別為82.0%和74%。齊健等[15]的研究結(jié)果與國(guó)外基本一致，Wif-1甲基化率為84.7%。Wif-1基因的啟動(dòng)子中存在T細(xì)胞相關(guān)因子（T cell factor，TCF）的反應(yīng)元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核內(nèi)靶因子，Wnt信號(hào)活化可使β-catenin在胞漿內(nèi)累積并進(jìn)入核內(nèi)識(shí)別淋巴結(jié)增強(qiáng)因子/T細(xì)胞相關(guān)因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等轉(zhuǎn)錄因子，激活Wnt信號(hào)的靶基因，控制胚胎發(fā)育及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究結(jié)果顯示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積聚及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。

本實(shí)驗(yàn)研究中筆者采用去甲基化藥物5'-Aza-CdR處理兩個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株：MSS細(xì)胞株HT-29和MSI細(xì)胞株LoVo后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，筆者發(fā)現(xiàn)DNA層面上DMSO對(duì)照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)都為未甲基化，說(shuō)明去甲基化藥物5′-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)Wif-1基因甲基化狀態(tài)，同時(shí)在mRNA層面上筆者發(fā)現(xiàn)在0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1基因的mRNA表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組上調(diào)，并且有時(shí)間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對(duì)照組比較，0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因的mRNA表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組上調(diào)，并且有時(shí)間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P= 0.000），與DMSO對(duì)照組比較，0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.656，P= 0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通過(guò)Western blot在蛋白層面上發(fā)現(xiàn)在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細(xì)胞株中Wif-1蛋白表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組上調(diào)，并且有時(shí)間、藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對(duì)照組比較，1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細(xì)胞株中Wif-1基因的蛋白表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組略微上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對(duì)照組比較，0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t= 102.233，P=0.000）。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示甲基化酶抑制劑5′-aza-dC可通過(guò)啟動(dòng)子甲基化而失活的Wif-1基因的異常甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，而使該抑癌基因恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，以使該基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮可能的抑制腫瘤的作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多種途徑和多種基因的改變，其中表觀遺傳學(xué)的變化逐漸受到醫(yī)學(xué)研究的重視。異常甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容，往往是導(dǎo)致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通過(guò)對(duì)異常甲基化的進(jìn)一步研究，來(lái)尋求結(jié)直腸腫瘤診斷的新標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)。

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Effect of 5-Aza-dC on m RNA expression,protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GEChang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping
Department of Pathology,the Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China

Ob jective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-dC),amethylation inhibitor,on the mRNA expression,protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines.Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC.Wif-1 gene DNA,mRNA and protein were determined by Methylight,SYBR Green PCR and Western blot respectively.HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lineswere treated with different dosages of 5-Aza-dC(0.5,1.0,1.5μmol/L).Wif-1 gene DNA,mRNA and protein were determined by Methylight,SYBR Green PCR and Western blot respectively.Results Methylight detection showed that the Wif-1 genemethylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC.Moreover,the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[(1.000±0.000), (1.207±0.052),(1.790±0.033),(2.016±0.123)],and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line[(1.000±0.000),(1.294±0.048),(1.893±0.061),(2.204±0.041)].Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover theWif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line[(0.456±0.040),(0.511±0.025),(0.857±0.031), (0.934±0.047)],and the protein expression was(0.842±0.032),(0.844±0.044),(0.854±0.037),(0.856±0.034),respectively in LoVo Colorectal cell line.The Wif-1 genemRNA effects within certain extent dose and time dependentwith statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line(F= 144.823,P=0.000)and LoVo Colorectal cancer line(F=476.195,P=0.000),and the Wif-1 protein effectswithin certain extent dose and time dependentwith statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line(F=129.674,P=0.000),but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line(F=0.117,P=0.948).Conclusion Themethylation of promoter region is amain cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines.5-Aza-dCmay effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

DNAmethylation;5-Aza-dC;HT-29;LoVo;Wif-1 gene

R735.3

A

1673-7210（2014）08（b）-0016-06

2014-02-11本文編輯：衛(wèi)軻）

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)基金課題（編號(hào)2011-5021-02）。

王魯平（1954.12-），女，碩士，主任醫(yī)師，北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科主任；研究方向：消化腫瘤病理。