河西走廊鹽堿土壤中抗立枯絲核菌的放線菌篩選

王蓓 牛世全 達(dá)文燕 李海云 胡嬌龍 趙國杰
（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 旱區(qū)微生物資源與生態(tài)研究所，蘭州 730070）

從甘肅省河西走廊鹽堿土中分離所得50株放線菌中，篩選出對立枯絲核菌有生防潛能的放線菌，旨在為生物防治作物病害提供新的菌種資源。通過平板對峙法、生長速率法及活體組織法篩選拮抗菌，并對其進(jìn)行形態(tài)及分子鑒定。經(jīng)過平板初篩，有4株菌株對立枯絲核菌有拮抗作用，編號Ⅰ18-5-2、Ⅲ22-3-12、Ⅳ16-3-2、DC009-1-23，其中Ⅳ16-3-2和DC009-1-23有較高的拮抗性，抑菌圈直徑分別為20.5 mm和15.5 mm；進(jìn)而對這2菌株進(jìn)行發(fā)酵液復(fù)篩，菌絲的生長抑制率分別為89.02%和80.49%；活體組織試驗(yàn)表明，Ⅳ16-3-2和DC009-1-23對立枯絲核菌的防治效果分別達(dá)54.29%和45.71%；通過形態(tài)培養(yǎng)特征和16S rDNA序列鑒定，將菌株Ⅳ16-3-2初步鑒定為變異鏈霉菌，DC009-1-23為丁香鏈霉菌。

立枯絲核菌 放線菌 鹽堿地 生物防治

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）是一種嚴(yán)重危害農(nóng)作物的土傳病原菌（也可侵染葉片），可引起多種農(nóng)作物的病害［1］。由立枯絲核菌引起的立枯病發(fā)生比較普遍，危害嚴(yán)重，可引起多種蔬菜瓜果和農(nóng)作物的病害，如油菜立枯病、水稻紋枯病等。目前尚缺乏對立枯絲核菌有效的抗病品種，主要通過農(nóng)藝措施和化學(xué)藥劑拌種的方法進(jìn)行防治［2］。但目前使用化學(xué)殺菌劑防治時(shí)由于其藥效持續(xù)時(shí)間短，因而農(nóng)民使用藥劑的次數(shù)和劑量逐步增加，其有害物質(zhì)在蔬菜、土壤中的蓄積量也逐漸增加，這種情況在溫室大棚蔬菜栽培中尤為突出，對人體健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大危害［3］。

真菌病害生物防治是克服病害化學(xué)防治造成環(huán)境污染、破壞生態(tài)平衡等缺點(diǎn)的有效途徑［4］。應(yīng)用于立枯絲核菌的生防因子很多，其中主要包括真菌、細(xì)菌（包含放線菌）等［1］。放線菌是產(chǎn)生抗生素的

主要微生物來源，在微生物產(chǎn)生的10 000多種生物活性物質(zhì)中，有50%以上是放線菌產(chǎn)生的，堪稱為次級代謝物的寶庫，應(yīng)用放線菌的生物資源有著巨大的社會效益和生態(tài)效益［5］。放線菌的抗生作用體現(xiàn)在次級代謝產(chǎn)物即抗生素對病原菌直接的抑制和致死作用。由于土壤中發(fā)現(xiàn)放線菌新種的幾率越來越小，因此研究者把目光集中到特殊生境區(qū)域［6-10］。

本研究從甘肅省河西走廊鹽堿土中分離放線菌，以期從中篩選出對立枯絲核菌有生防潛能的放線菌，這將為生物防治作物病害提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：由本研究所分離自甘肅省河西走廊鹽堿土壤中。供試靶標(biāo)菌：立枯絲核菌，由甘肅省農(nóng)科院植保所提供。主要培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基，小米浸液培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的活化 采用高氏一號培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)14 d后轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基備用。

1.2.2 放線菌對立枯絲核菌的直接拮抗作用 對分離到的50株放線菌，采用平板對峙法［11］進(jìn)行平板初篩。分別將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的立枯絲核菌菌餅（直徑8 mm）接種于另一PDA平板中心，并將培養(yǎng)5 d的放線菌邊緣菌餅（直徑8 mm）對稱接種在距中心2.5 cm處，重復(fù)3皿，以不接放線菌為對照。（25±1）℃培養(yǎng)3 d后測量其抑菌圈大小。

1.2.3 放線菌發(fā)酵液對立枯絲核菌抑菌活性的測定

1.2.3.1 發(fā)酵液的制備 待測菌株在高氏一號斜面培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)7-10 d，待其產(chǎn)生足量的孢子后制備菌懸液［12-16］。

1.2.3.2 抑制菌絲生長速率法 將放線菌菌株發(fā)酵液原液與PDA培養(yǎng)基按照1∶9的比例混合后，倒入直徑為9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)制成帶菌培養(yǎng)基，重復(fù)3次，以混合無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照。將病原菌餅（8 mm）接種于帶菌培養(yǎng)皿內(nèi)，菌絲面朝下，28℃培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落擴(kuò)展直徑，求出菌絲生長抑制率［17，18］。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑/對照菌落直徑）×100%

1.2.4 活體組織試驗(yàn) 采用組織法［19］測定發(fā)酵液對立枯絲核菌的室內(nèi)藥效，剪取生長良好的油菜葉片，清洗掉表面的雜物，晾干后在含有0.1% Tween-20供試發(fā)酵液中浸漬3 min，自然晾干。挑取病原菌餅倒扣在葉片中部，每個(gè)葉接種1個(gè)菌餅，未經(jīng)發(fā)酵液處理的葉片作為空白對照，每處理重復(fù)5次。將處理好的葉片放置在9 cm培養(yǎng)皿中保濕48 h，檢查病斑的大小。

抑制活性（%）=（1-處理病斑生長直徑/對照病斑生長直徑）×100%

1.2.5 菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：采用插片法［20，21］，將菌株劃線接種在高氏一號培養(yǎng)基上，在接種點(diǎn)附近斜插入滅菌的蓋玻片（1 cm×1 cm），28℃培養(yǎng)7 d后，取出蓋玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子絲形態(tài)。

分子學(xué)鑒定：供試菌株DNA提取參照黃大林［21］的方法。

16S rDNA序列擴(kuò)增和分析。 引物序列：P1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'P2：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，含上下游引物各1 μL、12.5 μL Premix ExTaq DNA聚合酶（由日本TAKARA公司生產(chǎn)）、2 μL DNA模板、8.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸2 min進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司測序，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST分析比對，采用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并且進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 抗立枯絲核菌放線菌的離體篩選

2.1.1 50株放線菌對立枯絲核菌拮抗作用測定結(jié)果 采用平板對峙法對50株放線菌進(jìn)行拮抗性初篩。試驗(yàn)結(jié)果如表1，有4株菌株即Ⅰ18-5-2、Ⅲ22-3-12、Ⅳ16-3-2、DC009-1-23對立枯絲核菌有不同程度的拮抗活性。其中Ⅳ16-3-2、DC009-1-23有較大的抑菌活性，抑菌圈直徑大于15 mm（圖1）。

2.1.2 兩株活性菌株發(fā)酵液對立枯絲核菌的抑制作用 利用生長速率法對初篩中對立枯絲核菌具有較

高拮抗性的2株放線菌（Ⅳ16-3-2、DC009-1-23）進(jìn)行活性復(fù)篩。這2株放線菌發(fā)酵上清液的10倍稀釋液對立枯絲核菌的生長抑制活性篩選結(jié)果如表2所示，菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23對立枯絲核菌的抑制活性均達(dá)到80%以上，抑菌效果顯著。

表1 拮抗放線菌對立枯絲核菌的初篩平板拮抗效果

圖1 菌株IV 16-3-2、DC009-1-23對立枯絲核菌的拮抗作用

表2 兩株高拮抗性放線菌發(fā)酵液對供試靶標(biāo)菌抑制率平均值

2.1.3 活體組織測定結(jié)果 對菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23進(jìn)一步進(jìn)行活體組織試驗(yàn)，測定菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23發(fā)酵液原液對油菜立枯病菌的藥效，結(jié)果如表3所示，其中Ⅳ16-3-2株菌的發(fā)酵液原液對油菜立枯病的藥效達(dá)到50%以上，藥效顯著（圖2）。

圖2 菌株IV 16-3-2、DC009-1-23對離體葉菌絲擴(kuò)展的抑制作用

2.1.4 菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23的鑒定

2.1.4.1 Ⅳ16-3-2、DC009-1-23的形態(tài)特征 Ⅳ16-3-2在高氏一號培養(yǎng)基上氣絲藍(lán)灰色，基絲黃色，孢子絲卷曲長鏈，孢子橢圓形。DC009-1-23在高氏一號培養(yǎng)基上氣絲近于藕荷色，基絲甘草黃色，孢子絲直，孢子橢圓形至柱形，表面光滑（圖3）。菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23是典型的鏈霉菌屬菌絲形態(tài)。

圖3 IV 16-3-2、DC009-1-23在高氏培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)

2.1.4.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序及與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

和同源性分析結(jié)果顯示（圖4），菌株Ⅳ16-3-2與Streptomyces variabilis（變異鏈霉菌）關(guān)系緊密，位于同一分支，同源性高達(dá)98%、DC009-1-23與Streptomyces lilaceus（丁香鏈霉菌）關(guān)系最緊密，位于同一分支，相似度高達(dá)99%。

圖4 鄰接法構(gòu)建菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23的16S r DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本試驗(yàn)采用平板對峙法和生長速率法對分離的放線菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩，平板對峙法的拮抗活性與菌絲生長速率、營養(yǎng)競爭和抗菌活性物質(zhì)等多種因素有關(guān)；而生長速率法是菌體產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)對病菌生長抑制作用的表現(xiàn)，是抗生素研究的基礎(chǔ)。菌株Ⅳ16-3-2和DC009-1-23對立枯絲核菌的生防作用較為明顯，其中Ⅳ16-3-2對離體油菜葉的防治效果突出。拮抗菌的盆栽試驗(yàn)及菌株活性物質(zhì)的提取還有待進(jìn)一步研究。

我國已經(jīng)登記注冊的農(nóng)用抗生素有幾十種，絕大多數(shù)抗生素產(chǎn)生菌為鏈霉菌屬，其中鏈霉菌已成為放線菌中數(shù)量最多而且產(chǎn)生抗生素種類也最多的一個(gè)屬［1］。本研究在傳統(tǒng)分類原則的基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)方法對目的生防菌株進(jìn)行了分類鑒定，兩株菌株也均為鏈霉菌屬［22，23］。

Byung等將玫瑰放線菌（Actinomadura roseola）等液培后分離提取出抗生素Da2B，它對立枯絲核菌有明顯的抑制作用。井岡霉素是防治水稻紋枯病非常理想的生物農(nóng)藥，它是由吸水鏈霉菌井岡變種（Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis Yen） 產(chǎn)生的。井岡毒素對水稻紋枯病的防效高、持效期長［24］。本研究中DC009-1-23、Ⅳ16-3-2兩株拮抗菌發(fā)酵液的抑菌率均高達(dá)80%以上，對于發(fā)酵液中拮抗物質(zhì)的提取有待于進(jìn)一步研究。

極端環(huán)境下如鹽堿地、高寒地帶等環(huán)境中的放線菌，由于生存環(huán)境特殊，代謝途徑與常規(guī)放線菌不同，因而成為新的拮抗物質(zhì)的重要來源［9］。從河西走廊鹽堿土壤中分離所得放線菌有較多對立枯絲核菌有生防作用的菌株，這些拮抗菌在供試病原菌的生物防治上有重要的應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)進(jìn)行深入研究。甘肅省河西走廊鹽堿地這種獨(dú)特類型的土壤中，還有大量的鏈霉菌資源等待進(jìn)一步開發(fā)。

4 結(jié)論

經(jīng)過平板初篩，有4株菌株對立枯絲核菌有拮抗作用，其中Ⅳ16-3-2和DC009-1-23有較高的拮抗性，抑菌圈直徑分別為20.5 mm和15.5 mm；菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23對立枯絲核菌的抑制活性均達(dá)到80%以上，抑菌效果顯著；菌株Ⅳ16-3-2發(fā)酵液原液對油菜立枯病的藥效達(dá)到50%以上，藥效顯著；將菌株Ⅳ16-3-2初步鑒定為變異鏈霉菌，DC009-1-23為丁香鏈霉菌。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of Actinomyces on Antagonism to Rhizoctonia solani Isolated from Saline-alkali Soils in Hexi Corridor

Wang Bei Niu Shiquan Da Wenyan Li Haiyun Hu Jiaolong Zhao Guojie
（Institude of Arid Microbial Resources and Ecology，College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070）

This study selected several actinomycetes from 50 strains of the saline-alkali soils of Hexi Corridor in Gansu Province which have been proved to be resistant to Rhizoctonia solani by antagonistic test, which would provide new strains resources in crop disease control. Pair culture method, growth rate method and tissue culture method were used to select antagonistic bacteria. The results of antagonistic test showed that there were 4 strains with antagonism to Rhizoctonia solani, which were namedⅠ18-5-2, Ⅲ22-3-12, Ⅳ16-3-2 and DC009-1-23. From above four strains, Ⅳ16-3-2 and DC009-1-23 had a higher antagonism and the diameters of inhibiting bacteria circle were 20.5 mm and 15.5 mm. By rescreening these two strains with higher antagonism from fermentation broth, the result showed that their mycelial growth inhibition rates were 89.02% and 80.49%. Biopsy tests showed that the control efficiency of IV 16-3-2 and DC009-1-23 to Rhizoctonia solani reached 54.29% and 45.71%, respectively. According to morphological characteristic and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence, the strain Ⅳ16-3-2 was preliminarily identified to be Streptomyces variabilis while the strain DC009-1-23 was identified to be Streptomyces lilaceus.

Rhizoctonia solani Actinomycetes Saline-alkali soils Biological control

2013-09-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31260134，30960078）

王蓓，女，碩士研究生，研究方向：微生物拮抗性；E-mail：wangbei0523@126.com

牛世全，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物資源和微生物生態(tài)；E-mail：sqniu@nwnu.edu.cn