崔倩 李潔 劉曉光

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津 300457）

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的赭曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

崔倩 李潔 劉曉光

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津 300457）

赭曲霉在工業(yè)上用于甾體C-11α羥基化。為了對(duì)現(xiàn)有赭曲霉生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造，以農(nóng)桿菌LBA4404作為侵染菌株，以赭曲霉（TCCC41060）作為受體菌株，以潮霉素B基因作為篩選標(biāo)記，成功建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的赭曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系并對(duì)其轉(zhuǎn)化效率的主要影響因素，如農(nóng)桿菌濃度、孢子濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和溫度等進(jìn)行了分析。在最佳條件下，轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到57個(gè)轉(zhuǎn)化子/108個(gè)分生孢子。隨機(jī)挑選的8個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子10代連續(xù)培養(yǎng)結(jié)果表明所獲得的轉(zhuǎn)化子能穩(wěn)定遺傳。該遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為赭曲霉菌株的定向遺傳改造提供了重要的操作平臺(tái)。

赭曲霉 根癌農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化體系

赭曲霉（Aspergillus ochraceus），屬于殼霉目，杯霉科，在自然界中分布廣泛。目前工業(yè)上主要應(yīng)用赭曲霉進(jìn)行甾體類藥物的C-11α羥基化反應(yīng)，如制備心血管藥物C-11α羥基化坎利酮［1］。若要進(jìn)一步提高赭曲霉對(duì)甾體類藥物的催化效率，需要從發(fā)酵條件優(yōu)化和菌株改造兩個(gè)方面進(jìn)行研究。到目前為止，有關(guān)赭曲霉催化甾體類藥物發(fā)酵條件優(yōu)化的研究已有不少，但是對(duì)赭曲霉菌株的定向改造報(bào)道并不多，僅有學(xué)者報(bào)道通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法敲除了赭曲霉中合成赭曲霉毒素A的pks基因［2］。本研究意在建立一個(gè)高效的赭曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而為生產(chǎn)菌株的定向遺傳改造奠定基礎(chǔ)。

目前已報(bào)道的絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化方法主要有CaCl2/PEG轉(zhuǎn)化法［3，4］、電擊轉(zhuǎn)化法［3，5］、基因槍轉(zhuǎn)化法［3，6］、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法［7，8］、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）［9］。綜合來(lái)看，CaCl2/PEG轉(zhuǎn)化法具有原生質(zhì)體的制備過程繁瑣、穩(wěn)定性較差、

再生頻率較低等缺陷［4］；電擊轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法同時(shí)具有需要特別儀器設(shè)備和轉(zhuǎn)化效率低的缺點(diǎn)［3］；限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法所獲得的突變子中很大比例的突變?yōu)榉菢?biāo)記突變，這為基因克隆和分析帶來(lái)很大困難［4］；而農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有較高的轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性較高，并且操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［10-12］。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。例如，日本曲霉［13］、泡盛曲霉［14］、黑曲霉［15］及煙曲霉［16］等。本研究利用農(nóng)桿菌LBA4404成功構(gòu)建了赭曲霉的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，并對(duì)影響其轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 赭曲霉TCCC41060、根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、質(zhì)粒pPZP-HYG和質(zhì)粒pCSN44均為本研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基［17］用于培養(yǎng)大腸桿菌；土豆培養(yǎng)基（PDA）［17］用于培養(yǎng)赭曲霉；YEB培養(yǎng)基［17］用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌；IM培養(yǎng)基［13］用于對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)和介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程的共培養(yǎng)。

1.1.3 試劑、抗生素和引物 各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker等購(gòu)自 TaKaRa 公司；乙酰丁香酮（AS）2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸鈉鹽（MES）購(gòu)自Sigma試劑公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

潮霉素B購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司；卡那霉素和頭孢霉素購(gòu)自購(gòu)自 TaKaRa 公司。

檢測(cè)潮霉素抗性基因的引物為HYG-F-（5'-GACATCGACACCAACGATC-3'），HYG-R-（5'-GACTCTTATTAGCAGACAGG-3'）由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 用XhoI和Hind III將潮霉素B基因片段從質(zhì)粒pCSN44上切下，同時(shí)用同樣的酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒pPZP-HYG上的6.5 kb片段切下，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPZP-hph。并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切和PCR驗(yàn)證，獲得正確的重組載體pPZP-hph。

1.2.2 潮霉素B對(duì)赭曲霉最小抑制濃度的確定 用無(wú)菌水將培養(yǎng)5 d的赭曲霉孢子從PDA斜面上洗下，經(jīng)4層紗布過濾后用玻璃珠打散，再用無(wú)菌水稀釋成107個(gè)/mL。取上述100 μL孢子懸液分別涂布于含有潮霉素B（濃度分別為0、50、100、150和200 μg/mL）的PDA平板上。放于28℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.2.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng) 將構(gòu)建好的載體（pPZP-hph）通過電擊轉(zhuǎn)化［18］的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)中，將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)化子在YEB（含卡那霉素50 μg/mL）平板上劃線，28℃培養(yǎng)72 h后，放于4℃?zhèn)溆?。挑取上述農(nóng)桿菌于含有5 mL的液體YEB（50 μg/mL）試管中，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，6 000 r/min，離心8 min收集菌體。用IM液體培養(yǎng)基重懸菌體，此時(shí)調(diào)整農(nóng)桿菌懸液OD600至0.5，并加入AS（濃度200 μmol/L）。放于28℃，180 r/min搖床中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。將農(nóng)桿菌培養(yǎng)到OD600=0.6、0.7、0.8、0.9、1.0時(shí)，分別取樣備用。

1.2.4 不同孢齡的赭曲霉孢子懸液的制備 保存在4℃中1個(gè)月的赭曲霉斜面用無(wú)菌水將孢子洗下，無(wú)菌紗布過濾后，用無(wú)菌水稀釋成1×107個(gè)/mL備用。將在28℃中培養(yǎng)5、6、7、8 d的赭曲霉斜面同上述方法分別稀釋成1×107個(gè)/mL備用。

1.2.5 赭曲霉不同孢子濃度的制備 用無(wú)菌水將培養(yǎng)5 d的赭曲霉孢子從PDA斜面上洗下，經(jīng)4層無(wú)菌紗布過濾除去菌絲體，并用無(wú)菌的玻璃珠將孢子打散均勻。將上述孢子懸液用無(wú)菌水稀釋成濃度為1×106、107、108和109個(gè)/mL。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證以及遺傳穩(wěn)定性的鑒定 隨機(jī)挑選了8個(gè)赭曲霉陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取其基因組DNA，用引物HYG-F和HYG-R對(duì)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。并以野生型赭曲霉基因組作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建

構(gòu)建含有潮霉素B基因的重組質(zhì)粒pPZP-hph，

構(gòu)建流程，如圖1所示。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的潮霉素B基因的片段（約1 390 bp），經(jīng)Hind III和XhoI酶切驗(yàn)證得到的6 500 bp和2 432 bp的DNA片段如圖2所示，證明含有潮霉素B篩選標(biāo)記的重組質(zhì)粒pPZP-hph構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒（pPZP-hph）的構(gòu)建

圖2 重組載體PCR（A）及酶切驗(yàn)證（B）結(jié)果

2.2 潮霉素B對(duì)赭曲霉最小抑制濃度的確定

將赭曲霉培養(yǎng)在含有不同濃度潮霉素B的PDA平板上，觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果如表1所示，隨著潮霉素B的濃度不斷提高，赭曲霉的生長(zhǎng)逐漸受到抑制。當(dāng)潮霉素濃度為200 μg/mL時(shí)，赭曲霉不能生長(zhǎng)。

表 1 赭曲霉41060對(duì)潮霉素B的敏感性

2.3 農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

將農(nóng)桿菌濃度OD600=0.6、0.7、0.8、0.9和1.0的菌懸液分別取200 μL與200 μL的1×107個(gè)/mL的赭曲霉孢子懸液混合，涂布于貼有0.45 μm的纖維素膜的IM（含卡那霉素50 μg/mL，AS 200 μmol/L）培養(yǎng)基上。放于25℃中共培養(yǎng)48 h后，再將上述纖維素膜倒貼于PDA（含有潮霉素B 200 μg/mL，頭孢霉素20 μg/mL）平板上。放于28℃繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，再對(duì)PDA平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。結(jié)果如圖3所示，隨著農(nóng)桿菌濃度的升高，轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)也逐漸增多，當(dāng)農(nóng)桿菌濃度達(dá)到OD600=0.8得到的轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)最多。

圖3 農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.4 赭曲霉的孢齡對(duì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率的影響

分別取已制備的不同孢齡的200 μL赭曲霉孢子懸液和200 μL OD600=0.7的農(nóng)桿菌懸液涂布于IM固體培養(yǎng)基上在25℃共培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接到PDA平板上放于28℃培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。 結(jié)果如圖4所示，對(duì)于新鮮培養(yǎng)的孢子，除了培養(yǎng)5 d的孢子轉(zhuǎn)化效率比較低，培養(yǎng)6、7和8 d的孢子轉(zhuǎn)化效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于保存1個(gè)月的赭曲霉孢子。其中，培養(yǎng)6 d的

赭曲霉孢子轉(zhuǎn)化率最高。

圖4 赭曲霉孢齡對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 赭曲霉不同孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

分別取已制備的不同濃度的赭曲霉孢子懸液200 μL和OD600=0.7的農(nóng)桿菌懸液200 μL涂布于IM固體培養(yǎng)基上在25℃共培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接到PDA平板上放于28℃培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。

結(jié)果如圖5所示，在赭曲霉孢子濃度為1×108個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率明顯較高，低于這個(gè)濃度時(shí)，轉(zhuǎn)化效率下降。在孢子濃度為1×109個(gè)/mL時(shí)，平板上的單菌落也較多，但是其中的假陽(yáng)性也較多，所以綜合來(lái)看，其轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低。

圖5 赭曲霉孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.6 最佳共培養(yǎng)溫度的確定

將農(nóng)桿菌在含有AS的IM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)，取200 μL菌液與等體積的濃度1×108個(gè)的赭曲霉孢子懸液混合，在22、24、26和28℃下共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)膜到含有潮霉素B的PDA平板上，篩選轉(zhuǎn)化子檢測(cè)侵染效率。 如圖6所示，最佳共培養(yǎng)溫度為24℃，高于24℃時(shí)，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過快。低于或高于這個(gè)溫度時(shí)，轉(zhuǎn)化效率都不高。

圖6 共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.7 最佳共培養(yǎng)時(shí)間的確定

將農(nóng)桿菌在含有AS的IM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)，取200 μL菌液與等體積的濃度1×108個(gè)的赭曲霉孢子懸液混合，在24℃下共培養(yǎng)24、48、72 h后，轉(zhuǎn)膜到含有潮霉素B的PDA平板上，篩選轉(zhuǎn)化子檢測(cè)侵染效率。 如圖7所示，最佳共培養(yǎng)時(shí)間為48 h，低于這個(gè)時(shí)間，轉(zhuǎn)化效率明顯降低。高于這個(gè)溫度時(shí)，產(chǎn)生的假陽(yáng)性較多。

圖7 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.8 轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證和遺傳穩(wěn)定性的鑒定

從平板上隨機(jī)挑選8個(gè)赭曲霉轉(zhuǎn)化子，并且以野生型赭曲霉做為對(duì)照，提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，8個(gè)轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出潮霉素片段約為1 390 bp，然而野生型赭曲霉的基因組作為模板時(shí)不能擴(kuò)增出潮霉素基因的片段。結(jié)果如圖8所示。

隨機(jī)挑選8個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至不含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)10代后，

將其轉(zhuǎn)接至含有潮霉素B終濃度為200 μg/mL 的PDA平板上。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子仍能正常生長(zhǎng)，保持了對(duì)潮霉素B抗性的穩(wěn)定性。由此表明突變體獲得的潮霉素抗性基因能夠穩(wěn)定的遺傳。

圖8 赭曲霉轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證

3 討論

甾體激素藥物是僅次于抗生素的第二類藥物，具有很強(qiáng)的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用［19］。目前我國(guó)對(duì)赭曲霉的研究主要是應(yīng)用其對(duì)環(huán)氧黃體酮、4-AD和左旋乙基甾烯雙酮進(jìn)行C-11α羥基化。甾體微生物轉(zhuǎn)化的方法與之前化學(xué)轉(zhuǎn)化法相比在一定程度上提高了轉(zhuǎn)化效率，但距離真正的工業(yè)生產(chǎn)還存在一定的差距。例如，赭曲霉在進(jìn)行甾體微生物轉(zhuǎn)化過程中會(huì)產(chǎn)生一種磚紅色色素，影響產(chǎn)物的分離純化［20］，并且現(xiàn)有菌株轉(zhuǎn)化率不高。因此甾體轉(zhuǎn)化工業(yè)急需引入新的技術(shù)手段或新思路來(lái)改善現(xiàn)狀。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化赭曲霉會(huì)受到很多因素的影響。首先，要選用新鮮的赭曲霉孢子。赭曲霉孢子培養(yǎng)時(shí)間不能太短，這可能是由于孢子還不夠成熟。孢子培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率也會(huì)有所下降。而且保存時(shí)間太久的孢子根本不能用于介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。

根癌農(nóng)桿菌的菌懸液濃度和赭曲霉孢子懸液的濃度也極其重要。二者各自有其最佳濃度，高于或低于這個(gè)最佳濃度都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的下降。當(dāng)農(nóng)桿菌濃度增加到OD600=0.8以上時(shí)，轉(zhuǎn)化率并沒有升高反而有下降的趨勢(shì)。這可能是由于農(nóng)桿菌的濃度增高導(dǎo)致其過度生長(zhǎng)［21］，抑制了赭曲霉的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化效率的下降。經(jīng)查閱其他研究報(bào)道，根癌農(nóng)桿菌對(duì)其他絲狀真菌進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)，都要對(duì)二者的初始濃度進(jìn)行優(yōu)化，可見其對(duì)農(nóng)桿菌侵染效率的影響［22］。

共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時(shí)間同樣是介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中的重要因素。農(nóng)桿菌的最佳培養(yǎng)溫度為28℃，但在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，溫度過低，農(nóng)桿菌不能生長(zhǎng)。而溫度過高又使得農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過快，也會(huì)造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。因此需要選擇一個(gè)最佳共培養(yǎng)溫度。同樣，共培養(yǎng)時(shí)間太短，侵染過程還沒有完全，而共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，又會(huì)造成假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子太多［23］。

總之，該轉(zhuǎn)化體系的成功構(gòu)建在一定程度上解決了赭曲霉菌株定向改造的困難，并為赭曲霉基因的其他相關(guān)研究提供了重要工具。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選用農(nóng)桿菌LBA4404，以赭曲霉TCCC41060為受體菌株，以潮霉素B為篩選標(biāo)記，成功地建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的赭曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系。并成功優(yōu)化了影響介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程的主要因素，獲得了較高轉(zhuǎn)化率。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation System of Aspergillus ochraceus

Cui Qian Li Jie Liu Xiaoguang
（Tianjinn Key Laboratory of Industrial Microbiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Ministry of Education，the College of Biotechnology，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457）

Filamentous fungus Aspergillus ochraceus TCCC41060 is an industrial strain used for microbial steroid C11-α hydroxylation. In order to create genetic tools for A. ochraceus, the transformation system of A. ochraceus was established using Agrobacterium tumefaciensmediated system（ATMT）. A. tumefaciens LBA4404 was used as the infective strain and hygromycin B gene as the selection marker. The major factors affecting the transformation efficiency including the concentrations of A. tumefaciens cell and A. ochraceus spores, co-culture time, and co-culture temperature were investigated. Under the best conditions, the transformation efficiency of 57 transformants/107spores was obtained. A. ochraceus transformants were confirmed by PCR amplification . Randomly selected 8 transformants were shown to be genetically stable after 10 rounds of successive cultivation. Results indicated this ATMT transformation system would provide important means for the directed genetic manipulation of this important industrial strain A. ochraceus TCCC41060.

Aspergillus ochraceus Agrobacterium tumefaciens Transformantion system

2013-12-05

崔倩，女，碩士，研究方向：赭曲霉11α-羥化酶基因；E-mail：cuiqianyi@163.com

劉曉光，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：酶與應(yīng)用微生物；E-mail：liu_xg@tust.edu.cn