麥志茂 蘇宏飛 李麗珍 張偲

（中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301）

紅樹(shù)林土壤微生物宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及兩種新穎的β-葡萄糖苷酶基因的鑒定

麥志茂 蘇宏飛 李麗珍 張偲

（中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301）

宏基因組技術(shù)是挖掘微生物新酶的重要途徑。通過(guò)構(gòu)建紅樹(shù)林土壤微生物Fosmid文庫(kù)，共獲得了約100 000個(gè)陽(yáng)性克隆，該文庫(kù)外源插入片段平均長(zhǎng)度約為30 kb，文庫(kù)容量達(dá)3 Gb。通過(guò)對(duì)文庫(kù)中10 000個(gè)克隆進(jìn)行功能篩選，獲得了17個(gè)具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。對(duì)其中2個(gè)表達(dá)β-葡萄糖苷酶的克隆進(jìn)行亞克隆，獲得2個(gè)新穎的β-葡萄糖苷酶的基因，分別命名MhGH3和bgl66。生物信息學(xué)分析表明，MhGH3基因由1 992個(gè)堿基對(duì)組成，bgl66基因由2 025個(gè)堿基對(duì)組成。在氨基酸水平上，MhGH3和bgl66編碼的蛋白質(zhì)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分別為64%和55%。

β-葡萄糖苷酶 纖維素酶 紅樹(shù)林 宏基因組文庫(kù)

纖維素由多糖組成，在植物體中每年光合作用可生成的生物質(zhì)高達(dá)1.5×103億t，是世界上最多的可再生生物質(zhì)資源。但是由于纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前這一巨大資源的絕大部分還不能被人類(lèi)所綜合利用［1］。纖維素酶是能將纖維素降解并最終轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，包括內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，簡(jiǎn)稱(chēng)EG），能隨機(jī)的在纖維素分子內(nèi)部切斷β-1，4-糖苷鍵；外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91，簡(jiǎn)稱(chēng)CBH），能從纖維素分子還原端和非還原端以纖維二糖為單位切斷β-1，4-糖苷鍵；β-葡糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21，簡(jiǎn)稱(chēng) BG），能水解纖維二糖生成葡萄糖［2］。

在纖維素降解過(guò)程中，β-葡萄糖苷酶能水解纖維二糖生成葡萄糖，解除產(chǎn)物纖維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用，在纖維素降解中起著關(guān)鍵作用。但是許多微生物的β-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶或者產(chǎn)量很低，并且大部分β-葡萄糖苷酶活

性易受末端產(chǎn)物葡萄糖的抑制［3］，所以挖掘酶活力高，不受葡萄糖抑制作用的β-葡萄糖苷酶在纖維素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇工業(yè)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

自然界中99%的微生物不易獲得純培養(yǎng)，未培養(yǎng)微生物也是地球上最大的尚未開(kāi)發(fā)的生物資源［4］。宏基因組技術(shù)不依賴(lài)于微生物培養(yǎng)，以特定環(huán)境中微生物總DNA為研究對(duì)象，大大增加了獲得新的生物活性物質(zhì)的機(jī)會(huì)，是一條找尋新基因及新酶的新途徑。紅樹(shù)林環(huán)境周期性遭受海水浸淹，兼有陸地和海洋環(huán)境的特點(diǎn)但又具有自身的獨(dú)特性，其土壤具有沼澤化特征，含鹽濃度高，植物凋落物非常豐富，富含木質(zhì)纖維素，土壤微生物多樣性高，大部分微生物能分泌降解木質(zhì)纖維素的酶類(lèi)［5］。目前對(duì)紅樹(shù)林土壤微生物纖維素酶的研究并不多，利用宏基因組技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建紅樹(shù)林土壤微生物宏基因組文庫(kù)，有望獲得新穎的纖維素酶及其基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和抗生素及其用量 大腸桿菌使用Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基和LA培養(yǎng)基（LB+ 1. 2% 瓊脂），在37℃條件下培養(yǎng)16 h。篩選培養(yǎng)基為含0.1%七葉苷和0.25%檸檬酸高鐵銨的LA平板。氨芐青霉素使用終濃度為100 μg/mL，氯霉素使用終濃度為12.5 μg/mL。

1.1.3 酶和試劑 限制性?xún)?nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司，F(xiàn)osmid文庫(kù)構(gòu)建試劑盒購(gòu)自Epicentre公司，七葉苷（Esculin）和PVPP（Polyvinyl Polypyrrolidone）購(gòu)自上海生工公司，瓊脂糖為進(jìn)口分裝，其他試劑藥品均為分析純。

1.1.4 紅樹(shù)林土壤樣品 紅樹(shù)林表層土壤（0-10 cm）樣品來(lái)源于海南省三亞市白鷺公園（18 15’04.43”N，10931’07.62” E），采集的樣品放入-20℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 紅樹(shù)林土壤微生物總DNA的提取和純化 紅樹(shù)林土壤微生物總DNA的提取采用直接法，方法參照文獻(xiàn)［6］，略有改動(dòng)。提取方法如下：

（l）稱(chēng)取5 g紅樹(shù)林土壤樣品，放入50 mL滅菌離心管中；（2）向樣品中加入13.5 mL DNA提取緩沖液：（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA［乙二胺四乙酸鈉］，100 mmol/L sodium phosphate［磷酸鈉］，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB［十六烷基三甲基溴化銨］，2% PVPP［交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮］，pH8.0），漩渦震蕩5-10 min，混合均勻；（3）將震蕩后的樣品置于搖床中振搖45 min，使得土壤勻質(zhì)化，加入1.5 mL 20% SDS，輕柔顛倒混勻，65℃水浴3 h，每隔30 min輕柔顛倒混勻樣品；（4）水浴裂解后，在10 000 g離心10 min；（5）上清液中加入氯仿/異戊醇（24∶l），混合均勻，在10 000 g離心10 min。（6）收集上清，加入0.6倍體積異丙醇，室溫下沉淀40 min，然后在10 000 g離心15 min收集核酸沉淀；（7）用70%乙醇洗滌核酸沉淀2次，最后將沉淀溶于100 μL無(wú)菌TE緩沖液中，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（8）粗提的紅樹(shù)林土壤微生物總DNA通過(guò)脈

沖電泳進(jìn)行純化，同時(shí)回收35-48 kb的片段。

1.2.2 紅樹(shù)林土壤微生物宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建 文庫(kù)構(gòu)建使用Epicentre公司FOSTMFosmid Library Production Kit試劑盒，將純化好并且大小合適的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，然后與pCC2FOS載體進(jìn)行連接，噬菌體包裝并感染大腸桿菌EPI300，然后涂布于含有12.5 μg/mL氯霉素的LA平板，37℃培養(yǎng)16 h。在平板上隨機(jī)挑取18個(gè)克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，BamHⅠ酶切，通過(guò)脈沖電泳檢測(cè)插入片段的大小分布。

1.2.3 文庫(kù)保存 短期保存：文庫(kù)克隆在平板上培養(yǎng)16 h后，在4℃冰箱中可暫時(shí)保存2-3個(gè)月。單克隆的長(zhǎng)期保存：挑取單菌落于含有LB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃培養(yǎng)16 h，加入終濃度為15%的甘油，保存于-80℃冰箱中。

1.2.4 β-葡萄糖苷酶活性篩選和克隆分析 配制含有0.1%七葉苷和0.25%檸檬酸鐵銨的LA篩選平板，將文庫(kù)中保存的克隆子接種至平板上培養(yǎng)16 h，菌落周?chē)霈F(xiàn)黑色水解圈的即為β-葡萄糖苷酶活性克隆。從篩選平板上挑取水解圈大的陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取Fosmid質(zhì)粒，并用 Sau3AⅠ進(jìn)行部分酶切，回收1-5 kb的片段，與經(jīng)過(guò)BamHⅠ酶切并去磷酸化后的pUC19載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，挑取在篩選平板產(chǎn)生黑色水解圈的亞克隆測(cè)序。DNA序列拼接后，采用NCBI的Blastn和Blastx進(jìn)行序列比對(duì)和分析。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將獲得的兩種β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列與GenBank中相似性最高的部分β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列用Clustal X軟件進(jìn)行完全比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件Mega 4進(jìn)行Neighbor-joining（NJ）分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.6 GenBank索引號(hào) β-葡萄糖苷酶基因MhGH3和bgl66在GenBank的索引號(hào)分別為KF424271和KF777107。

2 結(jié)果

2.1 紅樹(shù)林土壤微生物宏基因組DNA提取和純化

從紅樹(shù)林土壤中粗提DNA，獲得的DNA片段遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于35 kb（圖1），利用槍頭反復(fù)吹打?qū)NA進(jìn)行切割，然后進(jìn)行脈沖電泳分離純化，同時(shí)回收35-48 kb的片段，純化后的DNA大小在35 kb左右，其純度和大小滿(mǎn)足Fosmid質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建要求。

2.2 紅樹(shù)林土壤宏基因組文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)

將包裝好的噬菌體侵染大腸桿菌EPI300，共獲得約100 000個(gè)克隆的文庫(kù)，隨機(jī)挑取18個(gè)克隆，誘導(dǎo)使其產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒后提取Fosmid DNA，用BamHⅠ進(jìn)行酶切，脈沖電泳檢測(cè)（圖2）。結(jié)果所有質(zhì)粒除了1個(gè)8.1 kb的載體片段外，都含有插入片段，而且?guī)透鞑幌嗤?，其大小?0-55 kb之間，平均長(zhǎng)度約為30 kb，文庫(kù)容量達(dá)3 Gb，說(shuō)明文庫(kù)的容量大，插入片段多樣性高。

圖2 文庫(kù)質(zhì)粒的酶切分析

2.3 β-葡萄糖苷酶活性克隆的篩選

通過(guò)活性篩選，獲得了17個(gè)表達(dá)β-葡萄糖苷酶活性的克隆（圖3）。提取活性克隆Fosmid質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌EPI300，在含有七葉苷底物的平板上仍然具有β-葡萄糖苷酶活性，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶活性來(lái)自于Fosmid質(zhì)粒中插入片段上的β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)所產(chǎn)生。

2.4 兩種β-葡萄糖苷酶基因的鑒定

2.4.1 MhGH3基因的鑒定 從紅樹(shù)林土壤微生

物宏基因組文庫(kù)中選擇β-葡萄糖苷酶活性克隆子fosSCSIO2進(jìn)行亞克隆，最終獲得一個(gè)含有長(zhǎng)約3.8 kb插入片段的亞克隆子pUC-MhGH3，測(cè)序后用NCBI上的ORF Finder工具預(yù)測(cè)該DNA 序列，得到一個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），命名為MhGH3。MhGH3基因的ORF由1 992個(gè)堿基組成，G+C含量為59%，其編碼的蛋白質(zhì)MhGH3在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與來(lái)自Sphingomonassp.LH128的β-葡萄糖苷酶有64%的最高一致性。

MhGH3由663個(gè)氨基酸組成，屬于糖苷水解酶3家族（GH3），用SMART工具（Simple modular architectureresearch tool）對(duì)該基因編碼的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該MhGH3不含信號(hào)肽，自N端的第140-449位氨基酸為GH3家族功能域，第523-661位氨基酸為GH3家族C末端功能域，預(yù)測(cè)分子量為71.2 kD，理論等電點(diǎn)為4.57。

圖3 具有β-葡萄糖苷酶活性的陽(yáng)性克隆

2.4.2 bgl66基因的鑒定 從紅樹(shù)林土壤微生物宏基因組文庫(kù)中選擇β-葡萄糖苷酶活性克隆子fosSCSIO3進(jìn)行亞克隆，最終獲得一個(gè)含有長(zhǎng)約4.1 kb插入片段的亞克隆子pUC-bgl66，測(cè)序后用NCBI上的ORF Finder工具預(yù)測(cè)該DNA序列，得到一個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶基因的開(kāi)放閱讀框，命名為bgl66。bgl66基因的ORF由2 025個(gè)堿基組成，G+C含量為60.9%，其編碼的蛋白質(zhì)Bgl66在GenBank氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)中與來(lái)自Sphingomonassp. PAMC 26605的β-葡萄糖苷酶有55%的最高一致性。Bgl66由674個(gè)氨基酸組成，屬于糖苷水解酶3家族（GH3），用SMART工具對(duì)該基因編碼的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該Bgl66蛋白序列N端第1-23位氨基酸為信號(hào)肽序列，第79-339位氨基酸為GH3家族功能域，第373-662位氨基酸為GH3家族C末端功能域，預(yù)測(cè)分子量為71.4 kD，理論等電點(diǎn)為4.29。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

分析系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，MhGH3與來(lái)源于單胞菌屬的Sphingomonassp. LH128處于一組（圖4-A），而且Blastx分析表明MhGH3也與Sphingomonassp. LH128的β-葡萄糖苷酶相似性最高，所以推斷MhGH3可能是來(lái)自單胞菌屬的細(xì)菌。Bgl66與來(lái)源于單胞菌屬的Sphingomonassp. PAMC 26605處于一組（圖4-B），而且Blastx 分析表明Bgl66也與Sphingomonassp. PAMC 26605的β-葡萄糖苷酶相似性最高，所以推斷Bgl66可能是來(lái)自單胞菌屬的細(xì)菌。

3 討論

從環(huán)境微生物中獲取宏基因組DNA是構(gòu)建文庫(kù)的關(guān)鍵步驟。紅樹(shù)林土壤有機(jī)質(zhì)含量高，腐殖酸含量較多，對(duì)DNA的提取造成很大的困難。針對(duì)這些難題，目前已有關(guān)于紅樹(shù)林土壤總DNA提取的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［7，8］。本研究用含有PVPP的DNA提取液，使粗提的總DNA中腐殖酸含量大大降低，并提取得到大片段的DNA。利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠脈沖電泳，有效地對(duì)DNA進(jìn)行分離和純化，獲得了大小合適的高質(zhì)量紅樹(shù)林土壤微生物總DNA。對(duì)文庫(kù)的篩選方法有基于活性的功能篩選和序列篩選兩種方法，通過(guò)功能篩選，有可能獲得全新的功能特別的酶和基因［9］。對(duì)10 000個(gè)克隆進(jìn)行活性篩選，獲得了17個(gè)具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。最近的文獻(xiàn)報(bào)道，從Fosmid文庫(kù)中獲得纖維素酶陽(yáng)性克隆的概率一般為1/10 000或者更低［10］，我們獲得陽(yáng)性克隆的概率比文獻(xiàn)報(bào)道的高。通過(guò)對(duì)其中兩個(gè)表達(dá)β-葡萄糖苷酶活性的克隆進(jìn)行亞克隆，獲得了兩個(gè)β-葡萄糖苷酶基因，其編碼的蛋白質(zhì)序列與已知的β-葡萄糖苷酶相似性低，說(shuō)明具有較高的新穎性；在數(shù)據(jù)庫(kù)中與之相似性高的β-葡萄糖苷酶序列來(lái)源于基因組測(cè)序，其酶學(xué)性質(zhì)尚未表征。后續(xù)的試驗(yàn)將對(duì)獲得的新穎的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，研究其酶學(xué)性質(zhì)及其在工業(yè)中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

從紅樹(shù)林土壤樣品中獲得了大片段的總DNA，并構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量的紅樹(shù)林土壤微生物Fosmid文庫(kù)，文庫(kù)的庫(kù)容量大，插入片段多樣性高。從文庫(kù)

中鑒定兩個(gè)編碼潛在的β-葡萄糖苷酶基因，為新穎的β-葡萄糖苷酶基因。

圖 4 MhGH3（A）以及Bgl66（B）的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

［1］ Saha S, Roy RN, Sen SK, et al. Characterization of cellulaseproducing bacteria from the digestive tract of tilapia, Oreochromis mossambica（Peters）and grass carp,Ctenopharyngodon idella（Valenciennes）［J］. Aquaculture Research, 2006, 37：380-388.

［2］ Voorhorst W, Eggen R, et al. Characterization of the celB gene coding for beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeonPyrococcus furiosusand its expression and site-directed mutation inEscherichia coli［J］. J Bacteriol, 1995, 177：7105-7111.

［3］ Wood TM, Mccrae SI. Purification and some properties of the extracellular β-D-glucosidase of the cellulolytic fungusTrichoderma koningii［J］. J Gen Microbiol, 1982, 128：2973-2982.

［4］ Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］. Microbiol Rev, 1995, 59：143-169.

［5］ Hyde K, Lee S. Ecology of mangrove fungi and their role in nutrient cycling：what gaps occur in our knowledge? Asia-Pacific Symposium on Mangrove Ecosystems：Springer；1995, 295：107-118.

［6］ Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM. DNA recovery from soils of diverse composition［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62：316-322.

［7］ 楊建, 洪葵. 紅樹(shù)林土壤總 DNA 不同提取方法比較研究［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2006（1）：372-377.

［8］ Jiang YX, Zheng TL. Evaluation of different extraction buffers on the quality of mangrove soil DNA［J］. J Trop Oceanogr, 2011, 30（2）：87-93.

［9］ Yun J, Ryu S. Screening for novel enzymes from metagenome and SIGEX, as a way to improve it［J］. Microb Cell Fact, 2005, 4：8.

［10］ Kim SJ, Lee CM, Kim MY, et al. Screening and characterization of an enzyme with beta-glucosidase activity from environmental DNA［J］. J Microbiol Biotechnol, 2007, 17：905-912.

（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of a Mangrove Soil Metagenome Library and Identification of Two Novel β-Glucosidase Genes

Mai Zhimao Su Hongfei Li Lizhen Zhang Si
（Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301）

Metagenomics provides a means of exploring new enzymes in microorganisms. A mangrove soil metagenome library with 100 000 clones was constructed. The average length of inserted DNA fragment is about 30 kb, and the total capacity of inserted DNA reached about 3 Gb. Seventeen clones with β-glucosidase activity were detected by screening 10 000 fosmid clones. The subcloning and sequencing revealed two novel β-glucosidase genes（MhGH3 and bgl66）. Bioinformatics analysis indicated that MhGH3 and bgl66 composed of 1 992 bp and 2 025 bp in length, respectively. The deduced amino acid sequence of MhGH3 and bgl66 showed the highest sequence identity of 64% and 55% with the known β-glucosidase in GenBank datebase, respectively.

β-Glucosidase Cellulase Mangrove Metagenomic library

2013-12-13

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”）（2010CB833801），國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（41230962）

麥志茂，男，博士研究生，研究方向：海洋微生物酶的開(kāi)發(fā)與利用；E-mail：maizhimao@163.com

張偲，男，研究員，研究方向：海洋生物，海洋藥物；E-mail：zhsimd@scsio.ac.cn