詹海仙暢志堅(jiān)李光蓉賈舉慶郭慧娟張曉軍李欣喬麟軼楊足君

（1.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

小麥新抗源CH5383抗條銹病基因的遺傳分析及分子定位

詹海仙1，2暢志堅(jiān)2李光蓉1賈舉慶3郭慧娟2張曉軍2李欣2喬麟軼2楊足君1

（1.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

CH5383是新育成的源于中間偃麥草的滲入系，對(duì)小麥條銹病和白粉病均表現(xiàn)免疫。為明確其抗性來(lái)源、遺傳方式和抗病基因在染色體上的位置，將CH5383的系譜材料及其與高感條銹病品種（系）雜交的F1、F2和F2：3家系群體進(jìn)行條銹病抗性鑒定。結(jié)果表明，CH5383對(duì)條銹病的抗性源于中間偃麥草，對(duì)條銹病生理小種CYR32的抗性由一對(duì)顯性核基因控制，將此基因暫時(shí)命名為YrCH5383。從476對(duì)SSR引物中篩選到3對(duì)引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77與抗病基因連鎖，遺傳距離分別是8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。根據(jù)這兩對(duì)標(biāo)記在染色體上的位置，將抗病基因定位到3B染色體的長(zhǎng)臂上。3B染色體的長(zhǎng)臂還未見(jiàn)有正式命名的抗條銹病基因的報(bào)道，推測(cè)YrCH5383可能是一個(gè)源于中間偃麥草的新抗條銹病基因。

小麥 條銹病 中間偃麥草 遺傳分析 分子定位

由條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型（Pucciniastriiformisf. sp.tritici）引起的小麥條銹病是嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)的三大病害之一［1］。實(shí)踐證明，培育抗病品種是防治該病最有效的方法。迄今，在小麥及其近緣物種中已經(jīng)正式命名了57個(gè)小麥抗條銹病主效基因，分布在54個(gè)位點(diǎn)上，編號(hào)Yr1-Yr54［2-5］。但是，由于小麥條銹菌變異頻率較高，平均約兩年會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的生理小種，抗源單一的抗病品種被新的條銹菌變

異小種克服而頻繁喪失抗性。因此，積極拓寬抗源的選擇范圍，充分利用抗條銹病基因源對(duì)條銹病抗性育種十分重要。

中間偃麥草（Thinopyrum intermedium2n=6x=42，JJsS）是小麥的近緣物種，具有對(duì)銹病、白粉病和黃矮病等小麥病害高抗或免疫等優(yōu)良性狀，是小麥抗病研究的重要基因源。我國(guó)學(xué)者通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交將中間偃麥草抗病基因?qū)肫胀ㄐ←溨?，已?jīng)獲得大量小麥與中間偃麥草的部分雙二倍體、代換系、附加系和易位系等材料［6-8］。由于這些材料導(dǎo)入的外源基因通常是大片段甚至整條染色體，除了有利基因外，一些不利的性狀也同時(shí)被導(dǎo)入到普通小麥中，不能直接用于抗病育種。所以，選育含有抗病基因的小片段滲入系，成為今后抗病育種工作的重點(diǎn)。

CH5383是通過(guò)小麥－中間偃麥草部分雙二倍體與感病小麥品種（品系）雜交和回交選育成的小片段滲入系。其系譜為京4ll/TAI7045//76216-96，TAI7045是暢志堅(jiān)［9］研究員選育的源于中間偃麥草的部分雙二倍體。用中間偃麥草DNA做探針進(jìn)行基因組原位雜交，未觀(guān)察到外源信號(hào)存在，說(shuō)明外源片段較小，需要用其它方法進(jìn)一步檢測(cè)。該材料對(duì)小麥條銹病和白粉病均表現(xiàn)免疫，具有分蘗力強(qiáng)、半矮稈、株型緊湊等優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，可作為優(yōu)良的抗性材料應(yīng)用于小麥抗病育種工作中。本試驗(yàn)對(duì)CH5383的條銹病抗性進(jìn)行遺傳分析，并對(duì)其所含的抗條銹病基因作染色體定位研究，旨在為有效地利用這個(gè)理想抗源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

CH5383是從八倍體小偃麥TAI7045與普通小麥品種雜交和回交高代品系中選育的小麥－中間偃麥草滲入系。用于抗性鑒定的抗病親本及3個(gè)抗感雜交的F1、F2和F2：3群體均由暢志堅(jiān)研究員育成并提供。

1.2 方法

1.2.1 苗期抗病性鑒定 苗期抗病性鑒定在溫室中進(jìn)行，待測(cè)材料一葉期時(shí)分別接種條銹病小種CYR31和CYR32，10-15 d后，待對(duì)照品種川育12充分發(fā)病后，進(jìn)行抗病性調(diào)查。條銹病分級(jí)采用0-4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 成株期抗病性鑒定 成株期抗性鑒定在電子科技大學(xué)農(nóng)場(chǎng)中進(jìn)行，鑒定材料包括：抗病品系CH5383，感病品種或品系SY95-71、臺(tái)長(zhǎng)29和綿陽(yáng)11，抗感雜交的F1、F2和F2：3群體。抽穗期人工接種條銹病小種CYR32，待對(duì)照川育12充分發(fā)病后調(diào)查抗性。按6級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)各群體的抗感分離情況［10］。

1.2.3 DNA提取及抗感池的建立 用SDS法提取抗感雙親和F2群體的184個(gè)單株DNA。從F2群體中選取10株抗性反應(yīng)型為0級(jí)的高抗單株等量混合成抗病池（Br），10株抗病等級(jí)為4級(jí)的高感單株等量混合成感病池（Bs），用于多態(tài)性標(biāo)記的篩選。

1.2.4 SSR分析 選取均勻分布于小麥ABD基因組21條染色體上的476對(duì)SSR引物，根據(jù)http：// wheat.pw.usda.gov公布的引物序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)在Icycler定量基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增體系為15 μL，包括：50 ng DNA，25 ng引物，1.5 nmol dNTPs，10×PCR Buffer和0.75 UTaq酶。反應(yīng)程序：94℃變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染觀(guān)察帶型并統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用軟件Mapmaker3.0分析多態(tài)性標(biāo)記與抗病基因的連鎖關(guān)系，并用MapDraw V2.1繪制連鎖圖。

2 結(jié)果

2.1 苗期抗病性鑒定

分別用條銹病生理小種CYR31和CYR32進(jìn)行苗期接種?？共⌒澡b定結(jié)果表明，抗病親本CH5383、抗性供體親本TAI7045和抗性野生親本中間偃麥草這兩個(gè)小種均表現(xiàn)抗病，而系譜中的4個(gè)普通小麥品種或品系全部屬于高感等級(jí)。這些均說(shuō)明，CH5383對(duì)條銹病的抗性來(lái)源于中間偃麥草。

2.2 成株期抗條銹基因的遺傳分析

連續(xù)3年分別對(duì)抗感親本、F1、F2群體和F2：3家系接種CYR32小種?？共⌒哉{(diào)查結(jié)果（表1、表2）表明，抗病材料與感病品種（系）正反交3個(gè)F1群體的抗性與抗病親本一致。F2代遺傳群體中，

CH5383與綿陽(yáng)11的后代群體中，抗病單株與感病單株的數(shù)量比為114∶45（χ2=0.854 2，P=0.355）；臺(tái)長(zhǎng)29與CH5383的反交組合中，抗病與感病的單株數(shù)分別是127株和50株（χ2=1.007 5，P=0.316）；CH5383與SY95-71的184株F2代分離群體中，141個(gè)單株的抗病表現(xiàn)屬于抗病類(lèi)型，43株屬于感病類(lèi)型，符合3R∶1S的期望分離比例（χ2=0.260 9，P=0.610）。CH5383/SY95-71的F2：3代家系中，純合抗病家系42個(gè)，分離家系87個(gè)，純合感病家系34個(gè)，抗性分離的比值符合1∶2∶1的分離比例（χ2=1.527 6，P=0.21 6）?？共⌒澡b定結(jié)果說(shuō)明，CH5383成株期的抗條銹病性狀是一對(duì)顯性核基因控制，暫時(shí)命名為YrCH5383。

表1 抗感雜交組合各世代對(duì)白粉病的抗性表現(xiàn)

表2 CH5383/SY95-71的F2：3家系成株期抗病性鑒定結(jié)果

2.3 抗病基因SSR標(biāo)記分析

利用分布在小麥21條染色體的476對(duì)SSR引物對(duì)抗感親本CH5383和SY95-71進(jìn)行標(biāo)記篩選，發(fā)現(xiàn)107對(duì)引物（占22.4%）在兩親本之間有多態(tài)性。將這些有多態(tài)性的標(biāo)記對(duì)構(gòu)建的抗感池進(jìn)一步篩選，有3對(duì)引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77在抗感池之間擴(kuò)增出與親本一致的特異性條帶（圖1）。Xbarc206是顯性標(biāo)記，而Xgwm108和Xbarc77是共顯性標(biāo)記。這3個(gè)標(biāo)記對(duì)CH5383/SY95-71雜交F2代群體的184個(gè)單株進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示，Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77與抗條銹病基因YrCH5383的遺傳距離分別為8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。Xgwm108在兩親本和抗感單株中分別擴(kuò)增出約140 bp和250 bp的特異條帶。Xbarc206在感病親本和感病單株中擴(kuò)增出大約290 bp的特異條帶。Xbarc77擴(kuò)增出的特異條帶分別為320 bp和280 bp。根據(jù)Somers等［11］整合的遺傳圖譜，Xbarc206位于染色體3B、4A和6A染色體上，Xgwm108和Xbarc77只在3B染色體上有擴(kuò)增位點(diǎn)，因此我們初步將YrCH5383定位到3B染色體的長(zhǎng)臂上。

3 討論

圖1 Xbarc206（A）及Xgwm108（B）在F2群體中的擴(kuò)增結(jié)果

小麥條銹病生理小種毒性變異較快，新的抗病品種在大范圍使用一段時(shí)間后，抗性會(huì)很快喪失。因此，充分開(kāi)發(fā)和利用小麥抗病基因源，是解決抗源單一化的有效途徑。已命名的條銹病基因中，來(lái)源于小麥近緣種屬的基因包括：源于頂芒山羊草（Ae.comosa2n=14，MM）的Yr8；源于黑麥（Secalecereale2n=14，RR）的Yr9；源于偏凸山羊草（Ae.

ventricosa2n=28，DDMM）的Yr17；源于粘果山羊草（Ae. kotschyi2n=28，UUSS）的Yr37；源于卵穗山羊草（Ae. geniculata2n=28，DDMM）的Yr40；源于三芒山羊草（Ae. neglecta2n=28，UUMM）的Yr42；源于中間偃麥草（Th. intermedium2n=42，JJsS）的Yr50［12-14］。其中來(lái)自黑麥1BL/1RS易位系的Yr9曾被廣泛用于小麥抗條銹育種中，在CYR28小種出現(xiàn)前，其載體品種洛夫林10和洛夫林13曾經(jīng)在全國(guó)大面積推廣和應(yīng)用［15，16］。由中科院西北植物所育成的源于長(zhǎng)穗偃麥草的小偃6號(hào)保持高溫抗病性長(zhǎng)達(dá)20年之久［17］。由此可見(jiàn)，偃麥草屬等近緣種屬是小麥條銹病良好的抗源，有待開(kāi)發(fā)和利用的抗病基因仍然比較多。本研究所用材料是八倍體小偃麥與普通小麥雜交后代選育的小麥－中間偃麥草滲入系，該材料具有半矮桿，株型緊湊，葉色深綠，分蘗力強(qiáng)，落黃好等優(yōu)良的農(nóng)藝性狀?？共¤b定結(jié)果顯示CH5383抗譜較寬，對(duì)條銹病和白粉病的多個(gè)生理小種均表現(xiàn)免疫，是小麥抗病育種工作中一個(gè)新抗源。

圖2 條銹基因YrCH5383在3BL上的遺傳圖

將外源野生物種的抗性基因?qū)肫胀ㄐ←湹倪^(guò)程中，由于大多數(shù)導(dǎo)入的目標(biāo)片段較大，除了有利性狀外，一些不利基因也被導(dǎo)入受體中，從而不利于在育種工作中的應(yīng)用。因此，創(chuàng)制含有目標(biāo)性狀的小片段染色體滲入系顯的尤為重要。CH5383是暢志堅(jiān)研究員通過(guò)六八雜交和回交選育成的小片段滲入系。CH5383的供體親本TAI 7045和野生親本中間偃麥草均高抗條銹病，系譜中的各小麥品種對(duì)條銹病表現(xiàn)高度感病，說(shuō)明CH5383中的抗病基因只能來(lái)源于中間偃麥草。用中間偃麥草DNA作探針，中國(guó)春DNA做封阻進(jìn)行GISH分析，未觀(guān)察到外源信號(hào)存在，說(shuō)明CH5383中的外源片段比較小，是一個(gè)中間偃麥草小片段滲入系。細(xì)胞學(xué)觀(guān)察CH5383結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，染色體數(shù)目是42條，與小麥品種中國(guó)春雜交F1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期染色體構(gòu)型為2n=21Ⅱ。但中間偃麥草在該材料中滲入片段的位置及大小仍需進(jìn)一步研究才能確定，目前此工作正在進(jìn)行中。

已命名的57個(gè)條銹病基因中，只有Yr50來(lái)源于中間偃麥草，該基因位于小麥染色體4BL上，而本試驗(yàn)中YrCH5383被定位在3B染色體的長(zhǎng)臂上。Yr50的抗病親本TAI7047是暢志堅(jiān)研究員選育的一個(gè)部分雙二倍體，其外源染色體包括：6對(duì)Js染色體、1對(duì)S組染色體和1對(duì)S/Js臂間易位染色體。CH5383的抗病親本TAI7045是暢志堅(jiān)研究員選育的另一個(gè)雙二倍體新類(lèi)型，其外源染色體包括：4對(duì)S組（1對(duì)隨體染色體），2對(duì)E組，1對(duì)S/E中間易位染色體［9］。據(jù)此推斷，本試驗(yàn)中小麥新抗源CH5383的抗條銹病基因與已命名的抗白粉病基因Yr50不同。目前在3B染色體上命名的抗條銹基因只有Yr30，且該基因位于3B染色體的短臂［18］。根據(jù)抗病基因來(lái)源和染色體位點(diǎn)分析，初步推斷YrCH5383可能是一個(gè)來(lái)源于中間偃麥草的抗條銹病新基因。

中間偃麥草滲入系CH5383對(duì)小麥多種病害均表現(xiàn)免疫，而且具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，可做為小麥抗病育種工作中良好的抗病材料加以運(yùn)用。明確CH5383中條銹病基因的遺傳方式和抗病基因的位置，對(duì)于充分利用這一條銹病新抗源，實(shí)現(xiàn)抗源多樣化的抗病育種目的具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究明確滲入系CH5383條銹病抗性源于其野生親本中間偃麥草，對(duì)條銹病生理小種CYR32的抗性由一對(duì)顯性核基因控制，該抗病基因YrCH538位于小麥染色體3B長(zhǎng)臂上。根據(jù)基因在染色體的位置初步確定YrCH5383是一個(gè)源于中間偃麥草的抗條銹病新基因。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Genetic Analysis and Molecular Mapping of Stripe Rust Resistance Gene in Wheat Line CH5383

Zhan Haixian1，2Chang Zhijian2Li Guangrong1Jia Juqing3Guo Huijuan2Zhang Xiaojun2Li Xin2Qiao Linyi2Yang Zujun1
（1. School of Life Science and Technology，University of Electronic Science and Technology of China，Chengdu 610054；2. Institute of Crop Science，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031；3. College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

CH5383 is an introgression lines from Thinopyrum intermedium with high resistance to wheat stripe rust and powdery mildew. The evaluations of disease were tested using Pst races CYR31 and CYR32 in seedlings. The result showed that the stripe rust resistance came from Thinopyrum intermedium in CH5383. Genetic analysis revealed that the resistance was controlled by a single dominant gene inoculating Pst race CYR32 inadult stage. It was temporarily named YrCH5383. Two polymorphic SSR markers, Xgwm108, Xbarc206 and Xbarc77 were linked to the resistance gene with genetic distance 8.2 cM, 10.7 cM and 13.6 cM, respectively. Based on marker loci and the origination, YrCH5383 might be a new gene to wheat stripe rust on 3BL.

Wheat Stripe rust Thinopyrum intermedium Genetic analysis Molecular mapping

2013-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171839），山西省留學(xué)基金項(xiàng)目（2012-102），山西省國(guó)際合作項(xiàng)目（2012081006-2）

詹海仙，女，博士研究生，研究方向：小麥分子生物學(xué)；E-mail：zhan030006@126.com

楊足君，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：yangzujun@uestc.edu.cn