王耀煥 王瑞娜 周前進(jìn) 陳炯

（寧波大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條快速檢測創(chuàng)傷弧菌檢測方法的建立

王耀煥 王瑞娜 周前進(jìn) 陳炯

（寧波大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）與橫向流動(dòng)試紙條（LFD）檢測聯(lián)合應(yīng)用，建立了一種新的快速、便捷的創(chuàng)傷弧菌檢測方法。針對(duì)創(chuàng)傷弧菌的外膜蛋白TolC基因設(shè)計(jì)6條特異性引物和1條異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的探針。生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物能夠特異性地與FITC標(biāo)記的探針雜交，雜交產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測。優(yōu)化后的擴(kuò)增溫度和時(shí)間為63℃反應(yīng)35 min，加上細(xì)菌基因組DNA提取步驟，完成檢測僅需要80 min。LAMP-LFD方法可特異性地檢出創(chuàng)傷弧菌，對(duì)哈維氏弧菌等9種水產(chǎn)品常見病原菌的檢測均呈陰性；對(duì)純細(xì)菌培養(yǎng)物的檢測靈敏度為3.7×102CFU/mL或7.4 CFU/反應(yīng)，是利用外引物建立的常規(guī)PCR檢測的100倍。結(jié)果表明，該方法能夠準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢出創(chuàng)傷弧菌，可應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌污染的水產(chǎn)品的檢測。

創(chuàng)傷弧菌 外膜蛋白TolC基因 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 橫向流動(dòng)試紙條檢測

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）為革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，普遍存在于江河口和沿海水域環(huán)境，魚類、蝦類，以及貝母類等為主要易感水生動(dòng)物［1］。該菌是人獸共患病的重要病原，人通常因生食受污染的海產(chǎn)品，或皮膚傷口接觸受污染的海水或海洋動(dòng)物而感染。感染該菌可導(dǎo)致患者出現(xiàn)原發(fā)性敗血癥、創(chuàng)傷感染、急性胃腸炎和蜂窩織炎等臨床癥狀［2，3］。每年美國與海產(chǎn)品相關(guān)的死亡事件中95%是由于感染了創(chuàng)傷弧菌［4，5］，眾多水產(chǎn)品中，牡蠣是創(chuàng)傷弧菌最重要的傳染源，為防治該病，加利福尼亞州特

地于2003年頒布法令禁止生牡蠣銷售，取得明顯防治效果［6］。在我國，創(chuàng)傷弧菌感染多發(fā)生于沿海地區(qū)，被列為食品污染源八大高危微生物之一［7-9］。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確而又適用于臨床的檢測方法對(duì)于有效診斷創(chuàng)傷弧菌感染，監(jiān)測水產(chǎn)品污染具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

傳統(tǒng)的創(chuàng)傷弧菌診斷主要通過病原分離與生化鑒定完成，但其存在細(xì)菌培養(yǎng)繁瑣，檢測周期長，不易鑒別相近物種或亞型等缺點(diǎn)［10］。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，以溶血素基因（Hemolysin）［11］、DNA回旋酶B亞基（gyrB）［12，13］、toxR基因［14］、RNA聚合酶σ亞基因子S（rpoS）［15］等為靶標(biāo)建立的常規(guī)PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)已成功應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的實(shí)驗(yàn)室診斷，具有靈敏度高，檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但該方法必須配備昂貴的儀器設(shè)備，需專門的操作人員。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由日本學(xué)者Notomi發(fā)明的一種新式恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)［16］，相對(duì)于PCR相關(guān)檢測技術(shù)，具有檢測時(shí)間更短，儀器依賴性小等優(yōu)點(diǎn)，具有應(yīng)用于現(xiàn)場疫源地檢測的巨大潛力。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠的方法進(jìn)行判定，但該方法存在操作過程易污染，易出現(xiàn)假陽性的缺點(diǎn)。LAMP與橫向流試紙（Lateral flow dipstick，LFD）技術(shù)聯(lián)用（LAMP-LFD），使FITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性雜交，不僅可避免非特異性擴(kuò)增引起的假陽性，大幅提高檢測靈敏度，還能避免因瓊脂糖凝膠電泳等檢測手段引起的體系污染問題［17，18］。該方法亦無需特殊設(shè)備，不需與EB等有毒試劑接觸，操作更加便捷和安全。

本研究根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因的保守性區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立LAMP-LFD技術(shù)，旨在將該方法應(yīng)用于水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificusATCC 27562）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyiATCC 33866）、河流弧菌（Vibrio fluvialisATCC 33809）購自中科院水生生物研究所；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticusATCC 33847）由浙江省疾控中心惠贈(zèng)；輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianusDSM 17186T）由寧波大學(xué)海洋學(xué)院張德民教授惠贈(zèng)；溶藻弧菌（Vibrio alginolyticusATCC 17749）、鰻弧菌香魚分離株（Vibrio anguillarumayu-H080701）［19］、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilaAh0201）由本實(shí)驗(yàn)室保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC 19115）購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)和基因組DNA提取 試驗(yàn)中使用的弧菌劃線接種于TCBS固體培養(yǎng)基上，28℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于堿性蛋白胨水中震蕩培養(yǎng)至所需濃度；嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌，以及單增李斯特菌劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于LB或BHI培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至所需濃度。

細(xì)菌基因組DNA的提取采用水煮法完成，主要步驟為：取1 mL細(xì)菌的液體培養(yǎng)懸液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，棄上清；使用100 μL細(xì)菌裂解液（Tris-HCl 0.1 mol/L，蛋白酶K 0.2 μg/μL，Triton X-100 2.0%）充分懸浮細(xì)菌，沸水浴10 min，立即冰浴7 min；重復(fù)上一步操作1次；12 000 r/min離心2 min，取上清用作LAMP和PCR擴(kuò)增的模板，-30℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上公布的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因（登錄號(hào)：DQ296643），設(shè)計(jì)用于LAMP擴(kuò)增的外引物TolC-F3、TolC-B3，內(nèi)引物TolC-FIP、TolC-BIP，以及環(huán)引物TolC-LF、TolCLB等6條特異性引物，同時(shí)合成TolC-HP探針1條，用于LFD的雜交試驗(yàn)（表1，圖1）。在內(nèi)引物TolC-FIP的5'端標(biāo)記生物素，在TolC-HP的5'端標(biāo)記異硫氰酸熒光素。以上引物和探針由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。其中，外引物TolC-F3、TolC-B3同時(shí)用作PCR擴(kuò)增的特異性引物，擴(kuò)增的預(yù)期片段大小約為308 bp。

1.2.3 LAMP擴(kuò)增條件的確立 選用創(chuàng)傷弧菌基因組DNA的2個(gè)濃度（經(jīng)平板計(jì)數(shù)法測定，較高模板

濃度相當(dāng)于3.7×107CFU/mL，較低模板濃度相當(dāng)于3.7×104CFU/mL）作為模板優(yōu)化擴(kuò)增條件。LAMP反應(yīng)體系為25 μL，包括Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8），MgSO46.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，Triton X-100 0.1%，甜菜堿 1.6 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外引物TolC-F3和TolC-B3各0.2 μmol/L，內(nèi)引物TolC-FIP和TolC-BIP各1.6 μmol/L，環(huán)引物TolC-LF和TolC-LB各0.4 μmol/L，Bst DNA聚合酶（New England BioLabs，美國）8 U，創(chuàng)傷弧菌基因組DNA模板 2 μL。陰性對(duì)照不加任何模板DNA。反應(yīng)混合物在一定溫度下溫育后，經(jīng)80℃熱激5 min終止反應(yīng)，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。分別以上述較高濃度和較低濃度的基因組DNA為模板，選擇10、20、35、50和65 min作為擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間65℃恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果確定最佳反應(yīng)時(shí)間；分別在61、62、63、64 和65℃下進(jìn)行溫育至篩選的最佳反應(yīng)時(shí)間，根據(jù)擴(kuò)增效果確定適宜的反應(yīng)溫度。

表1 根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因序列設(shè)計(jì)的LAMP-LFD擴(kuò)增引物序列和探針

圖1 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因的LAMP-LFD引物序列和探針設(shè)計(jì)示意圖

1.2.4 利用橫向流動(dòng)試紙條（LFD）檢測 檢測所用試紙條購自Milennia Biotec GmbH（Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec GmbH，Germany，http：//www.milenia-biotec.de/），可通過其檢測線上標(biāo)記的生物素抗體與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合完成檢測。利用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，使用經(jīng)生物素標(biāo)記的內(nèi)引物TolC-FIP-biotin進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束時(shí)不經(jīng)過終止反應(yīng)，而將20 pmol的FITC標(biāo)記的DNA探針TolC-HP加入到反應(yīng)液中，63℃雜交5 min；取5 μL雜交液加入到100 μL buffer中混勻；將LFD試紙條浸入buffer溶液中3-5 min，肉眼判斷結(jié)果。

1.2.5 LAMP-LFD的特異性試驗(yàn) 選擇水產(chǎn)品中的常見病原菌用于LAMP-LFD的特異性試驗(yàn)，除創(chuàng)傷弧菌外，還包括哈維氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、輪蟲弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌等9種。分別利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.6 LAMP-LFD的靈敏度測定 將創(chuàng)傷弧菌的原始菌液（相當(dāng)于3.7×109CFU/mL）進(jìn)行連續(xù)10倍濃度梯度稀釋，按水煮法提取基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。分

別利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴(kuò)增結(jié)果。同時(shí)，在相同模板濃度下，以外引物TolC-F3和TolC-B3為特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）（TaKaRa，日本）0.15 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL，TolC-F3（10 pmol/μL）1 μL，TolC-B3（10 pmol/μL）1 μL，基因組DNA模板 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 LAMP-LFD的重復(fù)性試驗(yàn) 重新挑取創(chuàng)傷弧菌的單菌落，培養(yǎng)后獲取新鮮創(chuàng)傷弧菌原始菌液，經(jīng)平板計(jì)數(shù)后，連續(xù)10倍濃度梯度稀釋至LAMPLFD檢測的最低濃度，平行制備3個(gè)樣品，按水煮法提取基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的可重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴(kuò)增條件的確立

以較高濃度基因組DNA（3.7×107CFU/mL）為模板65℃恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)，反應(yīng)10 min即可檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)20 min，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度幾乎達(dá)到最高值，延長反應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2-A）。以較低濃度基因組DNA（3.7×104CFU/mL）為模板65℃恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)，反應(yīng)10 min未能檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)20 min，可檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)35 min，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度幾乎達(dá)到最高值，延長反應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2-B）。為保證樣品檢測時(shí)，在較低模板濃度下仍盡可能地檢出病原，選擇LAMP擴(kuò)增的最佳反應(yīng)時(shí)間為35 min。

為確定最適反應(yīng)溫度，以較低濃度基因組DNA（3.7×104CFU/mL）為模板，分別使用61、62、63、64和65℃ 5個(gè)不同溫度進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增35 min。5個(gè)反應(yīng)溫度下均檢測到明顯的特異性擴(kuò)增，而不添加任何DNA模板的反應(yīng)管中未檢測到擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為63℃時(shí)，特異性擴(kuò)增中出現(xiàn)的梯形條帶最為清晰（圖3），因此選定63℃為最適反應(yīng)溫度。最終確定63℃反應(yīng)35 min為最適反應(yīng)條件。

2.2 LAMP-LFD檢測與特異性試驗(yàn)結(jié)果

按優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系，換用生物素標(biāo)記的內(nèi)引物TolC-FIP-biotin進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模板的反應(yīng)管可出現(xiàn)特征性的梯形條帶，其他9株病原菌的反應(yīng)管中未見明顯擴(kuò)增（圖4-A）。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測發(fā)現(xiàn)，以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物可使試紙條的檢測線位置出現(xiàn)明顯的陽性條帶，其他9株病原菌的反應(yīng)產(chǎn)物在試紙條的檢測線位置未出現(xiàn)條帶（圖4-B）。

圖2 LAMP反應(yīng)時(shí)間的確立

圖3 LAMP反應(yīng)溫度的確立

圖4 LAMP（A）和LAMP-LFD（B）特異性分析

2.3 LAMP-LFD的靈敏度測定

創(chuàng)傷弧菌原始菌液（相當(dāng)于3.7×109CFU/mL）進(jìn)行連續(xù)的10倍濃度梯度稀釋后，分別采用水煮方法提取其基因組DNA。以不同濃度的基因組DNA為模板進(jìn)行的LAMP-LFD結(jié)果顯示，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測的最低模板濃度為原始濃度的10-7倍，即3.7×102CFU/mL或7.4 CFU/反應(yīng)（圖5-A）；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)試紙條（LFD）檢測的最低模板濃度與電泳檢測結(jié)果一致，即3.7×102CFU/mL或7.4 CFU/反應(yīng)（圖5-B）。而以同批次的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可檢測的最低模板濃度為原始濃度的10-5，即3.7×104CFU/mL或740 CFU/反應(yīng)（圖5-C）。因此，LAMP-LFD方法的靈敏度是利用外引物TolC-F3、TolC-B3建立的常規(guī)PCR方法的100倍。

2.4 LAMP-LFD的重復(fù)性分析

獲取3個(gè)新鮮的創(chuàng)傷弧菌原始菌液樣品，經(jīng)平板計(jì)數(shù)后，連續(xù)的10倍梯度稀釋至最低檢測濃度（約為3.7×102CFU/mL），利用水煮方法提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行LAMP-LFD擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測均可獲得明顯的陽性結(jié)果（圖6），說明該方法可重復(fù)，穩(wěn)定性好。

圖5 LAMP（A）、LAMP-LFD（B）和PCR（C）檢測的靈敏度比較

3 討論

創(chuàng)傷弧菌屬于沿海海洋環(huán)境中的自然菌群之一，海水、海洋沉積物和各種水產(chǎn)品中均可分離獲得，尤以牡蠣感染率最高，由于該病原可感染人，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的原發(fā)性敗血癥和壞死性創(chuàng)傷感染，因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，有效檢測海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的污染具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究選擇創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因作為檢測靶標(biāo)，成功建立了LAMP-LFD技術(shù)。從提取細(xì)菌基因組DNA到結(jié)果判讀，整個(gè)檢測過程僅需80 min，包括擴(kuò)增反應(yīng)35 min，擴(kuò)增產(chǎn)物L(fēng)FD顯色10 min。

基于分子生物學(xué)的檢測手段中，常規(guī)PCR技

術(shù)最早應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌檢測［11］；依賴于TaqMan 探針的RT-qPCR技術(shù)亦應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的實(shí)驗(yàn)室診斷［14，15］。這些技術(shù)均需以較為昂貴的儀器設(shè)備為依托，尤其RT-qPCR技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備、試劑，甚至操作環(huán)境要求較高，必須由專業(yè)人員操作，難以在多數(shù)基層檢測機(jī)構(gòu)或現(xiàn)場疫源地推廣。LAMP檢測技術(shù)具有設(shè)備依賴性小、特異性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)疾病檢測［20-23］。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的LAMP-LFD技術(shù)，可有效避免因LAMP非特異性擴(kuò)增引起的假陽性問題，使得檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可信，已得到越來越多科技工作者的青睞［17，18，24，25］。本研究建立的LAMP-LFD技術(shù)可檢出的創(chuàng)傷弧菌最低濃度為3.7×102CFU/mL，即7.4 CFU/反應(yīng)，檢測靈敏度是利用外引物TolC-F3、TolC-B3建立的常規(guī)PCR方法的100倍。Han等［26］以創(chuàng)傷弧菌的溶血素vvhA基因作為檢測靶標(biāo)，建立了可特異性檢測創(chuàng)傷弧菌的LAMP方法，靈敏度達(dá)到了20 CFU/mL；Hossain等［27］針對(duì)groEL基因建立了可同時(shí)檢測創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌的雙重PCR技術(shù)，針對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢測靈敏度達(dá)到了50 CFU/反應(yīng)。本研究利用LFD法的檢測靈敏度與瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果一致，但LAMP-LFD法可在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果后的10 min內(nèi)完成結(jié)果判斷，簡化了檢測流程，而且能夠避免因電泳檢測引起的體系污染問題。特異性試驗(yàn)表明，該方法能特異性地檢測創(chuàng)傷弧菌，而對(duì)哈維氏弧菌等其他常見水產(chǎn)病原菌的檢測呈陰性。

圖6 LAMP（A）和LAMP-LFD（B）的重復(fù)性試驗(yàn)

4 結(jié)論

以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因?yàn)榘袠?biāo)建立的LAMP-LFD技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測創(chuàng)傷弧菌，檢測靈敏度達(dá)到7.4 CFU/反應(yīng)，儀器需求簡單，可滿足基層檢測機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場疫源地檢測的需要。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Rapid Detection of Vibrio vulnificus by Loop-mediated Isothermal Amplification Combined with Lateral Flow Dipstick Assay

Wang Yaohuan Wang Ruina Zhou Qianjin Chen Jiong
（Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Ningbo University，Ningbo 315211）

A novel and rapid loop-mediated isothermal amplification（LAMP）combined with chromatographic lateral flow dipstick（LFD）assay was developed to detect Vibrio vulnificus. A set of six primers and a fluorescein isothiocyanate（FITC）-labeled probe that recognized V. vulnificus outer membrane protein TolC gene were designed. Biotinylated LAMP amplicons were hybridized exclusively with the FITC-labeled probe and detected by LFD assay. The assay was optimized and could detect V. vulnificus by incubation at 63℃ for only 35 min, and the whole detection procedure from extraction of bacterial genomic DNA to the visualization of the amplicons by LFD last 80 min. V. vulnificus could be accurately detected by LAMP-LFD, and no amplification could be observed when another 9 bacterial genomic DNA were used. The sensitivity for V. vulnificus detection in pure culture was 3.7×102CFU/mL or equivalent to 7.4 CFU per reaction, which is 100 times higher than that of PCR assay. The results indicate that LAMP-LFD is an accurate, rapid and sensitive tool for V. vulnificus detection and can be used for detection of V. vulnificus in contaminated aquatic foods.

Vibrio vulnificus Outer membrane protein TolC gene Loop-mediated isothermal amplification Lateral flow dipstick assay detection

2013-10-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2012AA020101，2012AA092001），寧波大學(xué)學(xué)科項(xiàng)目（xk11341）

王耀煥，男，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：wangyaohuan5949@163.com

周前進(jìn)，男，博士，講師，研究方向：動(dòng)物疫病診斷技術(shù)；E-mail：mumu2325@163.com