李志輝，任蓓蕾，朱健輝，杜萍萍，張瑩瑩，何俊萍，張 偉，王 頡，檀建新，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071001；2.中國科學(xué)院北京基因組研究所，中國科學(xué)院基因科學(xué)與信息重點實驗室，北京100101）

一株產(chǎn)乙酸乙酯酵母C42的分離與鑒定

李志輝1，任蓓蕾1，朱健輝2，杜萍萍1，張瑩瑩1，何俊萍1，張 偉1，王 頡1，檀建新1，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071001；2.中國科學(xué)院北京基因組研究所，中國科學(xué)院基因科學(xué)與信息重點實驗室，北京100101）

從采自滄州良種棗繁育基地的200份棗果實樣品中利用含有10%乙醇的YPD平板分離、篩選得到了36株耐酒精酵母菌株，其中一株酵母能產(chǎn)生愉悅的水果香味，命名為C-42。通過形態(tài)學(xué)，生理生化實驗和18S rDNA序列同源性比對，證明該株酵母菌是異威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus）。氣相色譜分析表明酵母菌株C-42在麥芽汁培養(yǎng)基中發(fā)酵一周后可產(chǎn)生乙酸乙酯，濃度可達154mg/L，說明該菌株在發(fā)酵工業(yè)中具有應(yīng)用潛力。

產(chǎn)香酵母，氣相色譜，乙酸乙酯

酵母菌是單細胞真核微生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的偏酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物葉子上，以及果園土壤中等[1]。生香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，主要屬于產(chǎn)膜酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數(shù)小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發(fā)酵產(chǎn)香的重要菌種[2]。雖然生香酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的能力弱于釀酒酵母，但能夠合成多種酶，將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)換成風(fēng)味物質(zhì)如酯、酸、高級醇和醛等產(chǎn)物，對調(diào)味品和酒的風(fēng)味、質(zhì)地和色澤的形成起到重要的作用。此外，還能抑制發(fā)酵過程中一些腐敗微生物的繁殖[3-5]。在白酒發(fā)酵過程中，由于其產(chǎn)乙醇能力低，不適合作為酒精發(fā)酵的主要菌種，而是將其與釀酒酵母一起混合使用[6]，與單獨使用釀酒酵母相比，得到的酒類風(fēng)味更為豐富，香味更加突出[7-8]，更受消費者歡迎，因而生香酵母是白酒等生產(chǎn)和發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)中重要的微生物菌種資源，新的生香酵母菌株分離和應(yīng)用對開發(fā)和生產(chǎn)具有特色風(fēng)味的酒類和發(fā)酵調(diào)味品具有重要意義。

乙酸乙酯是酒類等發(fā)酵產(chǎn)品的主要香味物質(zhì)之一，是產(chǎn)香酵母發(fā)酵產(chǎn)生脂類主要成分[9-10]。本實驗從棗果實中分離出來一株產(chǎn)香能力突出的酵母菌種，通過形態(tài)學(xué)，生理生化實驗和18S rDNA序列對比分析，確定為Wickerhamomyces屬的Wickerhamomyces anomalus。通過氣相色譜（GC）測定其產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯的量。為該菌株的后續(xù)實驗研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗果實樣品 采自滄州棗良種繁育基地，棗成熟時候收獲的無病蟲害的果實；乙酸乙酯（色譜純） 購自天津康科德科技有限公司；18S rDNA上游引物和下游引物[11]由大連寶生物有限公司合成；2×EsTaq Master Mix 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T載體 購自大連寶生物；H2SO3（分析純）和95%乙醇溶液 均購自天津市福晨化學(xué)制劑廠；麥芽汁 購自保定生力啤酒廠；實驗所需的其他試劑 均購自大連寶生物公司。

GC-7960型氣相色譜儀 美國Agilent公司；TGWAXMS毛細管色譜柱（60m×0.25mm×0.25μm） 美國Thermo公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基用于酵母分離純化，玉米粉瓊脂培養(yǎng)基觀察假菌絲，產(chǎn)子囊孢子培養(yǎng)基，維生素生長培養(yǎng)基等用于酵母生理生化實驗的培養(yǎng)基均參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[12]。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母的分離純化 將取自滄州良種棗繁育基地的200份棗果實樣品分別稱取1g加入含有8%乙醇的5mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)3d。取200μL富集液，稀釋100倍均勻涂布在含有10%乙醇的YPD固體平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2d。挑選出含有香味的平板，挑取其單菌落進行劃線分純，直至連續(xù)3代均有香氣，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)一致。

1.3.2 酵母的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實驗 將純化的酵母菌株分別接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5～7d，觀察產(chǎn)孢子和產(chǎn)假菌絲的情況；糖發(fā)酵實驗：供試的糖包括：葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和棉子糖；碳源同化：根據(jù)需要選用18種碳源作為同化實驗對象，包括：半乳糖、棉籽糖、赤蘚糖醇、蔗糖、可溶性淀粉、核糖醇、麥芽糖、D-木糖、D-甘露糖醇、纖維二糖、L-阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、檸檬酸、乳糖、L-鼠李糖和肌醇；氮源同化：氮源包括為硝酸鉀、鹽酸乙胺、鹽酸尸胺和L-賴氨酸；放線菌素酮抗性實驗；維生素生長測試；脲酶實驗。以上實驗的具體操作過程參見《酵母菌的特征與鑒定手冊》[12]。

1.3.2.2 18S rDNA鑒定 酵母DNA提取的操作過程參見文獻[13-14]。PCR擴增體系和條件：18S rDNA PCR擴增反應(yīng)的上游引物是5’-GTAGTCATATGCTT GTCTC-3’，下游引物是5’-GGCTGCTGGCACCAGA CTTGC-3’。反應(yīng)在20μL的體系中完成，其中包括2μL模板DNA，上下游引物各1μL，2×EsTaq MasterMix 10μL，蒸餾水6μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，反應(yīng)30個循環(huán)后72℃延伸10min。

膠回收、連接及測序：將PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖進行凝膠電泳分離，將目的條帶切下，按照膠回收試劑盒里的說明書，進行目的片段回收。將回收后的PCR產(chǎn)物與pMD-18連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，挑選陽性轉(zhuǎn)化子進行驗證測序[14]，測序由北京華大基因公司完成。

DNA序列比對和系統(tǒng)樹構(gòu)建：將測序結(jié)果在NCBI的BLAST網(wǎng)頁上比對，確定與生香酵母18S rDNA序列相似度最高的序列和微生物種，比對并生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 麥芽汁發(fā)酵 在300mL的三角瓶中加入120mL麥芽汁培養(yǎng)基（11°Brix），加入300μL H2SO3（終濃度60mg/L），接入5%已活化的生香酵母菌種，同時接種等量的市售的釀酒酵母作為對照。30℃條件下發(fā)酵，每天稱重，直至重量變化小于0.5g時停止發(fā)酵。每組實驗重復(fù)3次。

1.3.4 酒樣制備 參照文獻[15]蒸餾酒樣的方法獲得酒的蒸餾液。

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸乙酯的測定 采用TG-WAXMS毛細管色譜柱（60m×0.25mm×0.25μm），色譜條件：進樣口溫度240℃。升溫程序：初始溫度40℃保持2min，隨后以5℃/min升溫至80℃，再以20℃/min升至220℃，保持10min；載氣為氦氣，流速1mL/min，分流比20∶1。

稱取乙酸乙酯（分析純）的標(biāo)準(zhǔn)品4.00g于10mL的容量瓶中，用60%的乙醇溶液溶解并定容到10mL，得到乙酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別吸取儲備液用60%乙醇稀釋，配成乙酸乙酯濃度分別為0.01、0.02、0.08、0.20、0.32mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別以1μL進樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取蒸餾的酒樣以1μL進樣。每個酒樣重復(fù)3次。應(yīng)用氣相色譜的自帶的軟件計算峰面積。

用EXCEL軟件建立乙酸乙酯含量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品中的乙酸乙酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母菌株C-42的分離純化和形態(tài)特征

圖1 生香酵母C-42的菌落和菌體形態(tài)（400×）Fig.1 The colonial and cell morphology of aroma-producing yeast strain C-42（400×）

從滄州棗良種繁育基地采集棗樣品，利用高濃度乙醇抑制酵母以外的微生物生長的方法篩選得到了36株酵母菌，其中一株酵母菌能產(chǎn)生明顯的水果香味，經(jīng)過分離純化后，香味保持不變，將該菌株命名為生香酵母C-42。YPD平板培養(yǎng)基上生香酵母C-42的單個菌落呈圓形，邊緣整齊，中心突出，乳白色，表面濕潤，粘稠，易挑起。在400倍顯微鏡下觀察，C-42的單個菌體呈圓形，無鞭毛，無假絲，體積較大，具有典型的真核細胞的結(jié)構(gòu)特點，且出芽生殖（圖1）。在產(chǎn)孢培養(yǎng)基可看到部分細胞產(chǎn)子囊孢子，且每一子囊內(nèi)含有1～4枚子囊孢子，子囊孢子呈光滑的圓形或禮帽形，在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上沒有觀察到假菌絲。

2.2 生香酵母C-42的生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》，通過糖的發(fā)酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化實驗、放線菌酮實驗、無維生素培養(yǎng)基的生長情況、尿素水解實驗，對生香酵母C-42進行了生理生化鑒定，結(jié)果見表1。根據(jù)表1中生香酵母C-42生理生化的實驗的結(jié)果，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》，初步判定該菌株屬于Wickerhamomyces anomalus。

表1 生香酵母C-42的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the aroma-producing yeast strain C-42

2.3 生香酵母C-42的18S rDNA分子生物學(xué)鑒定

因為酵母菌等真菌的18S rDNA相對較為保守，其堿基序列變化能在一定程度上反映出種屬的變化，因此，18S rDNA序列常被用來做為酵母菌的分類鑒定上的依據(jù)。在生理生化鑒定的基礎(chǔ)上，對生香酵母C-42的18S rDNA進行了PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一條清晰的約500bp的條帶，其大小與預(yù)測擴增片段的長度一致，表明擴增出了正確的片段（圖2）。

將該片段測序，其序列在NCBI（WWW.NCBI. COM）上進行Blast比對，結(jié)果表明生香酵母C-42測定的500bp大小的DNA片段與公布的Wickerhamomyces anomalus菌株的18S rDNA序列在相同區(qū)域的相似度均為100%，而與其他物種的親緣關(guān)系較遠，根據(jù)其18S rDNA比對結(jié)果使用Bioedit軟件所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。根據(jù)上述結(jié)果初步判斷該菌株為Wickerhamomyces anomalus，結(jié)合前面形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，確定該菌株為Wickerhamomyces anomalus。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析Fig.2 Agarose gel analysis of PCR products

圖3 生香酵母C-42（lcl|24981）系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the aroma-producing yeast strain C-42（LCL24981）

2.4 生香酵母C-42產(chǎn)乙酸乙酯的檢測

生香酵母C-42能產(chǎn)生濃郁的水果香味，與乙酸乙酯氣味相近，初步判定其香味物質(zhì)可能是乙酸乙酯。所以用氣相色譜檢測生香酵母C-42發(fā)酵麥芽汁之后產(chǎn)生的乙酸乙酯，圖4是樣品通過氣相色譜的圖譜，其發(fā)酵產(chǎn)物中含有多種成分，如乙酸乙酯、乙醇、正丙醇等，其中保留時間為11.32min的色譜峰與乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時間相同，表明該菌株具有乙酸乙酯的合成能力（見表2）。將生香酵母C-42和釀酒酵母分別在麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生的乙酸乙酯經(jīng)蒸餾提取后進行氣相色譜的檢測，根據(jù)乙酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式：y=163.93x-0.3594（R2=0.9999）計算其含量，經(jīng)測定可知，生香酵母C-42、釀酒酵母兩種不同的酵母菌株發(fā)酵7d所得乙酸乙酯含量分別為（153.27±0.23）mg/L和（8.62±0.55）mg/L，生香酵母C-42的乙酸乙酯產(chǎn)量是釀酒酵母的17.78倍，說明生香酵母C-42具有較強的乙酸乙酯合成能力。

圖4 酵母菌株C-42發(fā)酵后樣品氣相色譜圖Fig.4 The gas chromatogram of fermentation sample of the aroma-producing yeast strain C-42

表2 生香酵母C-42主要發(fā)酵產(chǎn)物的氣相色譜分析Table 2 The GC analysis of the main fermentation products of the aroma-producing yeast strain C-42

3 結(jié)論與討論

近年來關(guān)于產(chǎn)香酵母發(fā)酵產(chǎn)生的高濃幅度發(fā)酵混合物研究越來越受到人們的關(guān)注，而這些物質(zhì)是形成酒中香氣的主要成分。產(chǎn)香酵母的種類很多，目前研究較多的有檸檬型克勒克酵母、畢赤酵母屬、漢森酵母書、假絲酵母屬等[11，16]。將產(chǎn)香酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，在保證一定酒精度的同時，產(chǎn)香酵母產(chǎn)生大量的香氣物質(zhì)，以增加酒的香氣，改善酒的品質(zhì)，增加酒體的層次感，深受釀酒行業(yè)的推崇。有研究表明，利用產(chǎn)香酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵有效地控制了發(fā)酵行為，與純種釀酒酵母發(fā)酵酒比，在乙酸乙酯、乙酸香葉酯、乙酸異戊酯和二苯乙酯等成分含量上均有不同，所釀葡萄酒的特色更加突出[16]。也有人將釀酒酵母和產(chǎn)香酵母進行混菌發(fā)酵，得到的產(chǎn)品乙醇濃度為201.7mg/L，乙酸乙酯含量達到740mg/L[6]，在提高風(fēng)味物質(zhì)的同時，降低了總酸和高級醇的含量，有效改善了發(fā)酵液的風(fēng)味特性。

本實驗通過高濃度乙醇抑制細菌和霉菌的生長，從采自滄州棗良種繁育基地的棗果實樣品中分離純化得到了一株產(chǎn)生水果香味的酵母菌株C-42。通過形態(tài)學(xué)，生理生化實驗，18s rDNA序列比對分析的方法，鑒定該菌為異威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

通過氣相色譜測定了酵母C-42在麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)一周后發(fā)酵液帶有濃郁的酯香，類似水果的香味，產(chǎn)生乙酸乙酯的濃度為（153.27±0.23）mg/L，雖然較740mg/L較低，但本實驗中并未對C-42的生長及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，產(chǎn)酯能力已經(jīng)很高，表明該菌是一株能產(chǎn)生良好香氣的酵母菌株，有巨大的潛在價值進行更深入的研究，用于釀酒或酒精飲料類的生產(chǎn)，以增加酒的香氣，提高酒體的品質(zhì)。

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Isolation and identification of an ethyl acetate producing yeast strain C-42

LI Zhi-hui1，REN Bei-lei1，ZHU Jian-hui2，DU Ping-ping1，ZHANG Ying-ying1，HE Jun-ping1，ZHANG Wei1，WANG Jie1，TAN Jian-xin1，*
（1.College of Food Science，Agricultural University of Hebei，Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing，Baoding 071001，China；2.CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information，Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

Thirty six yeast strains which were resistant to alcohol on YPD plate containing 10%ethanol were isolated from 200 jujube fruit samples collected from Cangzhou Jujube Seed Breeding Base.Among these strains，a yeast strain producing pleasant fruit flavors，named C-42，were isolated.It was identified as Wickerhamomyces anomalus by the morphological，physiological and biochemical tests and the homological comparison of 18S rDNA sequence.Gas chromatography analysis showed that the yeast strain C-42 could produce ethyl acetate up to 154mg/L after a week-long fermentation in wort medium.The strain may have potential applications in the fermentation industry.

ester-producing yeast；GC；ethyl acetate

TS261.1

A

1002-0306（2014）08-0188-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.034

2013－07－16 *通訊聯(lián)系人

李志輝（1986-），男，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物技術(shù)。

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（2012GB2A200030）。