王穎楠，趙敏，徐惠成

骨髓間充質干細胞與脫細胞基質構建組織工程材料的研究進展

王穎楠，趙敏，徐惠成

1 簡述骨髓間充質干細胞（BMSCs）

1.1 BMSCs概念及其特點間充質干細胞（MSCs）是一類來源于中胚層的具有自我更新及多向分化潛能的干細胞，廣泛分布于骨髓、臍血、外周血、胎盤、胎肝、胎腎、胎肺、軟骨膜、骨膜、脂肪及肌肉等組織中。BMSCs具有長的突觸，最易獲取，因此是目前用于MSCs研究的主要來源。MSCs在特定的條件下可以誘導分化為跨系，甚至跨胚層的組織細胞，成為現(xiàn)代組織工程學中理想的種子細胞；同時，MSCs易于導入外源目的基因，易于外源基因的轉染和表達，因此也成為基因治療的首選細胞[1]。

1.2 BMSCs的體外分離和培養(yǎng)目前分離純化BMSCs的方法主要有4種：（1）貼壁篩選法；（2）密度梯度離心法；（3）免疫磁珠分離法，但后2種分離法價格昂貴、操作復雜，其應用受到了限制；（4）流式細胞儀分選法。二維培養(yǎng)技術已普遍采用，盡管逐步得到改善，但仍存在難以克服的缺點：（1）貼壁的表面積有限，細胞產量低；（2）無菌操作過程繁瑣，容易污染；（3）代謝產物逐漸堆積，排除不及時易引起細胞生長不良甚至退化；（4）細胞離開了體內同細胞外基質共同構成的三維立體結構，生物學行為受到影響，容易變異。因此，有人提出三維培養(yǎng)的設想。1998年，Qiu等[2]對鼠骨髓基質進行三維培養(yǎng)。Glowacki等[3]用膠原海綿作為載體進行三維灌注培養(yǎng)，減少了代謝產物的聚集，結果發(fā)現(xiàn)細胞外基質含量提高，所培養(yǎng)的細胞活性和功能均加強。大載體生物反應器已成功用于某些植物和動物細胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)，能否將其用于BMSCs的擴增培養(yǎng)，并形成產業(yè)化，從而滿足細胞工程和基因工程對種子細胞量的需求，還有待于一些問題的順利解決。

2 簡述脫細胞基質（ECM）

2.1 ECM的特點ECM是應用物理或

化學方法將異體或異種組織進行脫細胞處理，從而去除組織移植過程中引起排斥反應的相關抗原，以用于修復損傷組織的一種新型生物材料。ECM在生物補片材料領域具有重要的研究價值。ECM在組織學方面，它較好地保留了細胞外基質的主要成分和結構，為其植入體內修復缺損組織提供了物質基礎。從豬小腸（SIS）制備的具有顯著的組織來源特性，經(jīng)常作為ECM支架的原型參照物。在凍干狀態(tài)下，SIS含有90%的膠原，其中最主要的是I型膠原蛋白，并含有少量的III、IV、V和VI型膠原成分。豬膀胱制備的脫細胞膀胱基質（UBM）和SIS含有的膠原類型相同，但III型膠原含量稍多一些，并且UBM含有基底層特殊成分：VII型膠原，該型膠原是UBM區(qū)別于其他ECM的顯著特點[4]。在免疫學角度，它清除了具有強抗原性的各種細胞，所以組織抗原性明顯降低[5]。同時它具有良好的組織相容性這一生物學特點。不同組織來源的ECM顯然具有不同的特性。

目前ECM的應用方式有以下三種：（1）直接替代；（2）做為組織工程的支架材料；（3）埋植充填。ECM作為支架材料近年來發(fā)展迅猛，展示出強大的生命力及臨床應用前景。并且已有應用于臨床試驗的報道。

2.2 ECM的制備方法含水的組織薄片可以直接用于支架材料；數(shù)個含水的組織薄片可以經(jīng)真空壓縮成一個多層的支架材料；含水的組織薄片也可以冷凍；凍干的薄片可以經(jīng)粉碎制成微粒形式的材料；這種經(jīng)粉碎的材料可以經(jīng)胰酶消化制成液態(tài)的材料，可以再聚合成凝膠或者可以與合成聚合物聚合成一種混合的支架[6]。但常用的為酶消化法、滲透溶液法和去垢劑清洗法。去垢劑多采用聚氧乙烯辛基苯基醚（Triton-x100），胰酶多采用乙二胺四乙酸（EDTA）。

3 BMSCs與ECM構建組織工程材料

3.1 BMSCs與ECM構建組織工程材料的可能性組織工程學是近年來新興起的一門學科，受到了科學界的廣泛關注。其核心是利用組織工程學技術與生命科學的成果，將活細胞與生物材料結合，修復、重建、維持、恢復或提高人體組織的功能[7]。理想支架材料應具備以下要求：（1）有良好的組織相容性；（2）生物可降解性；（3）無免疫原性；（4）多孔性和高空隙率，利于細胞的黏附和生長，誘導組織再生；（5）可塑性；（6）有一定機械強度[8]。ECM作為一種天然細胞外基質生物材料，幾乎具備以上各種生物特性，ECM是種子細胞及再生相關分子復合良好支架，保留了細胞外基質的生理結構，為種子細胞的種植提供了良好的三維空間結構和生長環(huán)境。種子細胞可以進入脫細胞后，與ECM成分相互作用，產生新生組織。植入體內后，干細胞能在體內分化、增值，理論上能豐富組織細胞和組織結構，解決組織修復不足的矛盾，提高遠期效果。因此作為種子細胞的BMSCs與ECM構建是較理想的組織工程材料，具有良好的應用前景。

3.2 BMSCs與ECM構建組織材料的特性

3.2.1 生物相容性生物相容性是基質材料在應用前首先要解決的問題。細胞與材料的黏附是體外構建組織工程的前提和基礎，細胞必須與材料發(fā)生適當?shù)酿じ?，才能進行遷移、增殖、分化及生物學活性的表達。Zheng等[9]通過體內植入法證實脫鈣骨基質與BMSCs具有良好的生物相容性，且具有體內成骨及成軟骨能力。Wang等[10]將BMSCs與完全脫鈣骨基質在體外誘導培養(yǎng)成纖維軟骨組織，結果顯示完全ECM為多孔結構，孔隙較高，可提供寬大的內表面和空間，利于細胞的黏附和生長，鏡下觀察可見細胞良好地黏附于支架上，顯示出良好的生物相容性。

3.2.2 誘導活性Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，脫鈣骨基質具有良好的軟骨誘導活性，軟骨細胞共同培養(yǎng)后基質中有較多Ⅱ型膠原表達。Mauney等[12]發(fā)現(xiàn)三維的部分脫鈣骨較其他合成材料具有更強的骨誘導活性以及促進人的骨骼間充質干細胞分化的能力。

3.2.3 ECM的生物力學特性膠原纖維的構型因素對ECM支架的生物力學性能的影響非常關鍵，其排列和組合方式是由原組織器官的功能所需決定的。Sun等[13]制備的脫細胞骨基質在力學性質方面，較新鮮未脫細胞骨基質稍減弱，但兩組在彈性載荷、破壞載荷、彈性模量方面差異無統(tǒng)計學意義，說明脫細胞過程對骨松質力學性質無明顯影響。也有以新鮮豬肋骨為原料制備脫細胞骨基質，該材料的載荷-變形曲線顯示，得出材料的彈性模量顯著增加，但其壓縮破壞負荷、破壞極限、壓縮極限及極限比率等均有減少和降低，但與新鮮骨組織差異無統(tǒng)計學意義。也有用NaOH消蝕法制備脫細胞真皮基質，進行抗張力試驗，將ECM片與Marlex網(wǎng)（來自美國巴德公司）裁剪成2 cm×3cm大小的平片，置于夾持器上，以50 mm/min拉伸，記錄拉至補片完全斷裂時所用的力。將單獨ECM片與Marlex網(wǎng)行抗張力試驗發(fā)現(xiàn)：Marlex網(wǎng)的抗張力高于ECM。但植入體內5周后，ECM筋膜組織的抗張力高于Marlex筋膜組織。與文獻[14]報道相似。當對SIS進行雙軸力學性能測試的時候，其纖維排列方式使SIS顯示各向異性的力學特點，在纖維縱軸方向上具有很好的張力和切向力。加上外力后，ECM內的纖維排列會發(fā)生變化，不僅是膠原纖維從典型的彎曲狀態(tài)變成直線狀，而且纖維還可以向張力方向發(fā)生扭轉，只要在支架可承受的范圍內，這種扭轉是可以回復的，而且可以通過簡單的仿射模型對支架膠原排列變化進行預測。但是過強且不對稱的張力會造成扭轉的不可回復，從而造成支架的整個生物力學特性的改變。

3.2.4 ECM植入體內后的力學性能變化植入體內后，ECM的機械性能會發(fā)生變化[15]，這種變化和材料降解率、植入部位組織微環(huán)境和機械微環(huán)境關系密切，另外還和新生細胞種植并生成新細胞外基質的速度和范圍相關。一些研究表明：植入后短期內，由于ECM在體內的快速降解，會導致承受張力能力下降，這在大鼠膀胱和肌腱的替代實驗中，進行ECM的體內降解定量測定，均得出了類似結果。降解同時發(fā)現(xiàn)新生組織的替代，在重建的早期，降解較快，但新生的ECM組織卻未能完全替代，因此導致最

初的力學性能下降。但是，一旦遷入的細胞定植后開始在ECM上擴增，則產生快速的ECM支架重構，從而支架強度和力學性能重新獲得改善[16]。

4 盆底重建中的應用

盆底重建外科是一個新的亞學科，旨在研究由于盆底支持結構損傷、缺陷及功能障礙所致疾患的診斷與處理，其研究的主要問題是女性壓力性尿失禁（SUI）和盆腔器官膨出（POP）。

目前認為各種利用補片的術式是治療POP的最佳手段，臨床廣泛使用的聚丙烯合成材料的補片雖然療效確切的優(yōu)點，但具有順應性差、組織侵蝕性強及感染率高等缺點，并導致性交痛等相關并發(fā)癥。而選擇經(jīng)過ECM是克服上述固有缺陷的方法之一。ECM材料植入人體后最終會降解，通過致膠原組織增生、周圍組織移行而形成支撐結構，從而達到支撐盆底的作用。相對于傳統(tǒng)的聚丙烯補片，其優(yōu)點是組織侵蝕率低，術后性交痛、盆腔慢性疼痛及小便困難的發(fā)生率低，其順應性也相對較好。因此ECM補片有可能成為未來最有希望的盆底補片。

作為理想的盆底補片材料和理想的盆底組織工程支架，其標準其實并無差異：要求安全、相對持久、有一定抗菌性以適應盆底特殊環(huán)境；其次要有好的組織相容性，可降解的同時，能夠做到有效的盆底組織替代，而非瘢痕增生；另外，盆底為腹腔最低處，要求材料具有一定的強度能經(jīng)受腹壓增加時的張力，而且還要有一定的順應性，能緩解腹壓增加的力學傳導。

如果能在ECM材料上選擇干細胞作為種子細胞，構建組織工程補片應該是解決組織修復不足的關鍵，組織工程補片植入體內后，無異物排斥反應，具備良好的順應性，補充盆底組織，增加盆底強度，從而達到支撐盆底的作用，與當前的合成材料補片相比，具有顯著優(yōu)點。在ECM上種植具有多項分化潛能的細胞，該細胞不僅能進一步提高ECM的順應性，還能在體內分化，增殖，從而豐富盆底細胞和組織結構，解決組織修復不足的矛盾，提高遠期效果。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.080

R551.3

C

1671-0800(2014)08-1054-03

315040寧波，解放軍第113醫(yī)院（王穎楠、趙敏）；第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院（徐惠成）

徐惠成，Email:hanluowynan@foxmail.com